Fotodynamicky aktivní látky a jejich použití pro fotodynamickou terapii

Mgr. Ludmila ŽÁRSKÁ

Doctoral thesis

Photodynamically ActiveSubstances and Their Use for Photodynamic Therapy

Abstract:

Disertační práce se zabývá především hodnocením fotodynamického efektu způsobeného porfyrinovými fotosenzitizéry v in vitro podmínkách na buněčných liniích. Rakovina zůstává celosvětovým zdravotním problémem a je nemocí s největším dopadem na globální zdraví. I přes všechna nedávná technologická vylepšení jsou recidivy a metastázy stále hlavní příčinou smrti. Vzhledem k tomu, že fotodynamická terapie (PDT) neohrožuje ostatní léčebné možnosti a ve srovnání s chemoterapií nebo radioterapií představuje sníženou dlouhodobou morbiditu, jeví se jako slibná alternativní léčba pro některá nádorová onemocnění. Fotodynamická terapie je založena na příjmu molekuly fotosenzitizéru (PS), která po excitaci světlem o specifické vlnové délce reaguje s kyslíkem (O2) a vytváří reaktivní formy kyslíku (ROS) v cílových tkáních, což vede k buněčné smrti. Disertační práce je složena ze tří experimentálních částí. První část je zaměřena na evaluaci fotodynamického efektu dvou porfyrinových PS, konkrétně TMPyP a ZnTPPS4. Protinádorová aktivita byla ověřována na nádorových liniích - HeLa (karcinom děložního hrdla) a G361 (maligní melanom kůže), k aktivaci bylo použito světlo o vlnové délce 414 nm s plošnou hustotou energie 5 a 25 J/cm2 . Na základě získaných výsledků, lze konstatovat, že u obou buněčných linií výraznější fotodynamický efekt byl pozorován po aplikaci TMPyP a současně citlivější linií vůči TMPyP byly HeLa buňky. Vyšší fototoxicita u obou buněčných linií a testovaných PS byla zjištěna po ozáření s plošnou hustotou energie 25 J/cm2 . Druhá část hodnotila fotodynamický efekt sulfonovaných polystyrenových nanočástic (NP) se zapouzdřeným fotosenzitizérem TPP (TPP-NP) na nenádorové NIH3T3 (myší fibroblasty) a dvou nádorových buněčných liniích HeLa a G361. Účinnost byla ověřována v šesti koncentracích v kombinaci se čtyřmi různými časy ozáření LED diodovým zářičem s vlnovou délkou 414 nm. Větší fototoxický účinek byl dosažen u nádorových linií v porovnání s nenádorovou NIH3T3 linií. Na liniích HeLa a G361 byla zjištěna téměř identická účinnost TPP-NP, která byla nezávislá na koncentraci a plošné hustotě energie (platí pro 5 a 10 min, respektive 16,2 a 32,4 J/cm2 ), jež také způsobily největší fotodynamickou účinnost. Třetí část se věnuje výsledkům, které byly získány v průběhu šestiměsíční stáže na univerzitě v Miláně. Práce se zaměřuje na přípravu mikročástic (MP) na bázi kyseliny poly (mléčné - co - glykolové) (PLGA MP), charakterizaci a následnou funkcionalizací třemi polymery. Mikročástice PLGA s modifikovaným zeta potenciálem byly použity pro antibakteriální studii vlivu povrchového náboje na gram-pozitivní (G+ ) a gram-negativní (G- ) bakterie. Antibakteriální efekt PLGA MP se lišil v závislosti na použitém typu polymeru a bakteriálním kmenu. Nejvýznamnější antibakteriální efekt byl zaznamenán u PLGA MP modifikovaných chitosanem u bakteriálního kmene Staphylococcus aureus. Mechanismus antibakteriálního účinku PLGA MP může být výsledkem vlivu použitých polymerů nebo zeta potenciálu na povrchu PLGA MP, avšak nelze vyloučit ani synergický účinek zmíněného zeta potenciálu a použitých polymerů. Pro jednoznačné objasnění podstaty antibakteriálního efektu PLGA MP je potřeba provést další testy.

Abstract:

The dissertation mainly deals with the evaluation of the photodynamic effect caused by porphyrin photosensitizers in in vitro conditions on cell lines. Cancer remains a worldwide health problem and is the disease with the greatest impact on global health. Despite all recent technological improvements, recurrence and metastasis are still the leading cause of death. Since photodynamic therapy (PDT) does not threaten other treatment options and presents reduced long-term morbidity compared to chemotherapy or radiotherapy, it appears to be a promising alternative treatment for some cancers. Photodynamic therapy is based on the uptake of a photosensitizer (PS) molecule, which, upon excitation by light of a specific wavelength, reacts with oxygen (O2) and generates reactive oxygen species (ROS) in target tissues, leading to cell death. The dissertation consists of three experimental parts. The first part is focused on evaluating the photodynamic effect of two porphyrin PSs, namely TMPyP and ZnTPPS4. The antitumor activity was tested on tumor lines - HeLa (cervical cancer) and G361 (skin cancer - melanoma), for activation, light with a wavelength of 414 nm with a surface energy density of 5 and 25 J/cm2 was used. Based on the obtained results, it can be stated that for both cell lines a more pronounced photodynamic effect was observed after the application of TMPyP and at the same time the more sensitive line to TMPyP was HeLa cells. Higher phototoxicity in both cell lines and tested PSs was found after irradiation with a surface energy density of 25 J/cm2 . The second part evaluated the photodynamic effect of sulfonated polystyrene nanoparticles (NPs) encapsulated with TPP photosensitizer (TPP-NPs) on non-tumor NIH3T3 (mouse fibroblasts) and two tumor cell lines HeLa and G361. The effectiveness was verified in six concentrations in combination with four different irradiation times with an LED diode emitter with a wavelength of 414 nm. A greater phototoxic effect was achieved in tumor lines compared to the non-tumor NIH3T3 line. When testing HeLa and G361, an almost identical efficiency of TPP-NP was found, which was independent of concentration and areal energy density (valid for 5 and 10 min, respectively 16,2 and 32,4 J/cm2 ), which also caused the greatest photodynamic efficiency. The third part is devoted to the results obtained during a six-month internship at the University of Milan. The work focuses on the preparation of microparticles (MP) based on poly (lactic - co - glycolic acid) (PLGA MP), characterization and subsequent functionalization with three polymers. PLGA microparticles with modified zeta potential were used for an antibacterial study of the effect of surface charge on gram-positive (G+ ) and gram-negative (G- ) bacteria. The antibacterial effect of PLGA MP varied depending on the type of polymer and bacterial strain used. The most significant antibacterial effect was recorded for PLGA MPs modified with chitosan against the bacterial strain Staphyloccocus aureus. The mechanism of the antibacterial effect of PLGA MP may be the result of the influence of the used polymers or the zeta potential on the PLGA MP surface, but a synergistic effect of the mentioned zeta potential and the used polymers cannot be excluded either. In order to clearly identify the nature of the antibacterial effect of PLGA MP, further tests need to be carried out.

Keywords

fotodynamická terapie (PDT), polystyrenové nanočástice, fotosenzitizér, polymerní mikročástice, nádorové buněčné linie, mikroskopie atomárních sil, Gram-pozitivní bakteriální kmeny, Gram-negativní bakteriální kmeny

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 11. 2022

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. Hana Kolářová, CSc.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Biophysics / Medical Biophysics