Analýza funkce AHP2 proteinu v cytokininové signalizaci Arabidopsis thaliana

Bc. Pavel Reichman

Master's thesis

Functional analysis of AHP2 protein in Arabidopsis thaliana signaling pathway

Abstract:

V rámci diplomové práce byl připraven rekombinantní protein AHP2 a následně byly proti tomuto proteinu připraveny monoklonální protilátky Protilátky byly charakterizovány a použity pro detekci AHP2 proteinu in planta. Připravený konstrukt rekombinantní DNA pRSET B::(His)6-AHP2 byl použit pro expresi proteinu AHP2 nesoucího oligihistidinovou kotvičku na svém N konci. Protein byl produkován v heterologním organizmu E. coli a následně byl izolován dvoustupňovou purifikací pomocí chromatografických metod. V prvním kroku byla použita metalochelatační afinitní chromatografie využívající oligohistidinové kotvičky na fúzním AHP2 proteinu, v druhém kroku pak gelová permeační chromatografie. Purifikovaný protein byl použit jako antigen pro přípravu monoklonálních protilátek. Pomocí selekce hybridomů metodou ELISA a western blottingu se podařilo získat pět různých protilátek proti AHP2 proteinu. U získaných protilátek bylo určeno jejich optimální ředění pro western blotting a následně byla pomocí této metody stanovena jejich specifitu vůči ostatním proteinům rodiny AHP. U vybraných protilátek byla pomocí metody založené na imunoprecipitaci peptidů stanovena oblast proteinu obsahující epitop rozpoznávaný těmito protilátkami. Čtyři protilátky byly následně využity pro „whole mount“ in situ imunolokalizaci AHP2 proteinu v kořeni čtyřdenních semenáčků A. thaliana. Bylo stanoveno optimální ředění pro použitou metodu a popsán detekční profil protilátek.

Abstract:

I have prepared recombinant AHP2 protein and several monoclonal antibodies directed against this protein. I have characterized the antibodies and used them in a whole-mount immunodetection of AHP2 protein in planta. I have used recombinant DNA construct pRSET B::(His)6-AHP2 for expression of AHP2 protein carrying six histidine residues on its N-terminus. The protein was produced in E. coli and purified via two-step chromatography technique. In the first step, metalochelate affinity chromatography was used to purify the protein using the (His)6-tag. In the second step, the gel filtration chromatography was used. Purified protein was used as an antigen to immunize mice for monoclonal antibody production. Using a unique procedure combining ELISA and western blotting, I managed preparation of five monoclonal antibodies recognizing AHP2 protein. I have determined optimal working dilution of these antibodies for western blotting procedure. Subsequently, using this method I have determined the specificity of these antibodies against other proteins of the AHP family. For the two selected antibodies, I have determined fragment of the AHP2 protein, containing the epitope that is recognized by the respective antibody. For that I have used immunoprecipitation based method. I have used four of these antibodies for detection of AHP2 protein in 4 day old Arabidopsis seedlings using immunohistochemical technique for whole-mout in situ protein localization in roots. I have determined optimal working dilution for this method, and described the detection profile for each antibody.

Keywords

TCS, thaliana, arabidopsis, cytokinin, His-Asp, fosforylace, MAb, monoklonální, protilátky, fragmentové mapování, epitop, whole-mount, imunolokalizace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 22. 6. 2009
• Supervisor: RNDr. Lubomír Janda, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular Biology and Genetics