Efektivní screening bázových editorů v mutagenezi \kur{Drosophila melanogaster}

Bc. Adéla HEJZLAROVÁ

Diplomová práce

Anotace:

Bázové editory jsou poměrně novou metodou založenou na systému CRISPR Cas9, zavádějící cílené změny na konkrétní místo v genomu. V této práci byly navrženy komplementární gRNA ke čtyřem cílovým úsekům ležícím na spliceozomálních stranách exonů a intronů white genu u octomilek (Drosophila melanogaster). Následně byla zkoumána efektivita čtyř vybraných bázových editorů Target-AID; nos-B; nos-ABE7.10 a nos-AID a enzymu Cas9. Celkem bylo v teplotách 18, 25 a 28 °C sledováno 116 556 samců. I když se efektivita pohybovala v řádu procent, tak bylo nasbíráno 1906 mutantů. Ačkoli nukleáza Cas9 vykazovala vyšší účinnost editace, ve většině případů docházelo k větším změnám (inzerce a delece), zatímco bázové editory byly velmi precizní. Pro specifikaci změn v DNA byli vybráni běloocí a mozaicisní jedinci, kteří byli genotypizováni a sekvenováni. Jediný editor, u kterého nebyli zaznamenáni žádní mutantní samci je nos-AID.

Abstract:

Base editors are a relatively new method based on the CRISPR Cas9 enzyme introducing targeted changes to a specific site in the genome. In this work, complementary gRNAs have been designed to four target regions located on the spliceosomal sides of exons and introns of the white gene in the fruit fly Drosophila melanogaster. Subsequently, the efficiency of four selected base editors Target-AID; nos-B; nos-ABE7.10 and nos-AID and the nuclease Cas9 were investigated. A total of 116, 556 males were monitored at 18, 25 and 28 °C. Although efficiencies were in the order of percents, 1906 mutants were collected. Even though the Cas9 nuclease showed higher editing efficiency, the base editors provided way more precise changes in targeted regions. It also contained a higher number of unwanted indels, in contrast to single nucleotide changes generated using base editors. Selected white eyed and mosaic individuals were genotyped and sequenced. The only editor for which no mutant males were observed is nos-AID.

Klíčová slova

Octomilka, bázové editory, CAS9, genová editace, gen white

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 12. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. David Doležel, Ph.D.

JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Experimentální biologie - specializace Molekulární a buněčná biologie a genetika