Elektrochemické imunosensory pro detekci mikroorganismů

Bc. Petra Šišková, Ph.D.

Master's thesis

Electrochemical immunosensor for the detection of microorganisms

Abstract:

Biosensory jsou dnes intenzivně rozvíjeným odvětvím s širokými možnostmi uplatnění v různých oborech lidské činnosti. Velký rozvoj zažívají imunosensory. V této práci byly prozkoumány vlivy jednotlivých látek tvořících monovrstvu na povrchu sensoru vhodného pro detekci modelových organismů (E. coli a S. Typhimurium). Byly používány sítotiskem připravené sensory se zlatými pracovními elektrodami. Zabudování proteinu A do kovalentní monovrstvy během imobilizace zlepšuje reakci celého systému. Velmi vhodná je i blokace nespecifických vazeb pomocí albuminu. Povrch sensoru byl připraven od základního očištění až k nanesení bakterie do 2 dnů. Jako optimální se ukázala doba inkubace s E. coli 15 minut a s S. Typhimurium 60 minut. Celá detekce od přidání vzorku obsahujícího stanovovaný mikroorganismus na povrch až po vyhodnocení naměřených dat trvala do 2 hodin. Dále bylo prokázáno, že uskladnění zmražených bakterií nemá významný vliv na amperometrický signál. Vazba bakterií na zlatý povrch byla pozorována pomocí mikroskopu atomových sil (AFM) i fluorescenční mikroskopie. Byla zjištěna částečná křížová reaktivita mezi jednotlivými modelovými organismy. Pro E.coli i S. Typhimurium byl stanoven limit detekce (LOD) 1•103 CFU.ml-1.

Abstract:

Microorganisms are serious problem in human and veterinary medicine and food control. Early detection is very important for fast and successful medical treatment, but also for elimination of contaminated food products. The aim of this work was to prepare an immunosensor for the detection of two model microorganisms. These bacteria were Escherichia coli and Salmonella Typhimurium. The used sensors were prepared by screen-printed technology. The first part was focused on optimising the operating conditions and selection of compounds used for the formation of suitable covalent monolayer on the gold surface of the working electrode. The influence of using protein A was described. The sensor with this linker biomolecule was much more sensitive. In addition, a very good results provided blocking of nonspecific bonds with albumin. The monolayer of antibody was prepared within 2 days and the detection takes less than 2 hours. The storage of bacteria in freezer does not significantly increase the amperometric signal. The optimal incubation period for E. coli linking to antibody was 15 minutes and for S. Typhimurium 60 minutes. There was proved partial cross reactivity between these organisms in this monolayer. The limit of detection was for both bacteria 1•103 CFU.ml-1. Their binding to gold surface was further proved by using atomic force microscope and fluorescence microscopy.

Keywords

Imunosensor, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Amperometrie, Fluorescenční mikroskopie, AFM, Immunosensor, Amperometry, Fluorescence microscopy

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 4. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 11. 6. 2009
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.
• Reader: RNDr. Ivo Pluháček

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry