Příprava transgenních buněčných línií a jejich analýza

Bc. Ingrid Staňková

Diplomová práce

Preparation of transgene cell lines and their analysis

Anotace:

Cílená změna genetické informace v buňkách patří mezi základní metodické přístupy moderní molekulární biologie. Změny genetické informace buněk lze dosáhnout například vnesením cizorodé nukleové kyseliny do buněk. Tento proces u bakterií nazýváme transformace, u eukaryotických buněk pak transfekce. Existuje řada metodických přístupů jak transfekovat eukaryotické buňky udržované in vitro v buněčné kultuře. Volba metody závisí na různých parametrech zejména na typu buněk a velikosti nukleové kyseliny, která je do buněk vnášena. Přestože lze vhodnost určitých metodických postupů pro daný typ buněčné linie vyčíst z literatury, skutečnou funkčnost vybraných metodických přístupů je nutné vždy otestovat a naoptimalizovat v daných laboratorních podmínkách. Proto cílem předkládané diplomové práce bylo otestovat vybrané metody transfekce u několika rozdílných typů savčích buněčných linií. Nejprve se naamplifikovaly vybrané reportérové plasmidy v bakteriích kmene DH5α E.coli, které byly transformovány standardním postupem. Následovala isolace plasmidů pomocí komerčně dostupných kolonek. Vyisolované plasmidy byly použity k transfekci buněčných linií myších makrofágů RAW 264.7, lidských mikrovaskulárních endoteliálních buněk HMEC-1, lidských keratinocytů HaCaT, myších embryonálních kmenových buněk mES a myších embryonálních fibroblastů STO. Buněčné linie RAW 264.7, HMEC-1 a HaCaT byly tranfekované elektroporací plasmidem BIIluc, který nese promotor pro NF-κB a jako reportérový gen luciferasu. Za účelem zjištění aktivace NF-κB byly linie RAW 264.7 stimulovány LPS, linie HMEC-1 a HaCaT byly stimulovány TNF-α. U všech těchto buněčných linií došlo na základě stimulace k aktivaci NF-κB, což bylo dokumentováno zvýšenou luciferasovou aktivitou detekovanou luminometricky. Buněčné linie mES a STO byly transfekované lipofekcí plasmidem nesoucím gen pro zelený fluorescenční protein, jehož exprese je kontrolována promotorem cytomegaloviru. Dále byly tyto buňky transfekované lipofekcí plasmidem RARE-Luc, který nese promotorovou oblast citlivou na působení kyseliny retinové kontrolující expresi reportérového genu pro luciferasu. Úspěšnost tranfekce byla ověřena přítomností zeleného fluorescenčního proteinu detekovaného pomocí flowcytometru a odpověď buněk na kyselinu retinovou zvýšenou luciferasovou aktivitou. Celkově bylo ověřeno, že elektroporace i lipofekce jsou vhodné metody pro transfekci zvolených savčích buněčných linií. Plasmidy nesoucí reportérový gen se ukázaly jako vhodný metodický přístup pro detekci aktivace vybraných promotorových oblastí.

Abstract:

Targeted modulation of genetic information of cells belongs to basic methodological approaches of current molecular biology. The modulation of cell genetic information could be accomplish by for example introduction of heterogeneous nucleic acid into the cells. This process is called transformation in case of bacteria and transfection in the case of eukaryotic cells. Various methodological approaches exist to transfect eukaryotic cells grown in cell culture in vitro. Selection of method depends on various factors with the cell type and the size of introduced nucleic acid as the most important ones. Despite the possibility to suggest the most optimal methodological approach for cell transfection based on literature the actual functionality of selected methodological approaches has to be tested and optimalized in given laboratory. Thus the aim of this master thesis was to test functionality of selected transfection methods for different types of mammalian cell-lines. At first, selected plasmids were amplificated in bacteria of the strain DH5 α E.coli, which were transformed by standard procedure. The isolation of plasmids followed using commercially available columns. The isolated plasmids were used for the transfection of mouse macrophage cell line RAW 264.7, human microvascular endothelial cell line HMEC-1, human keratinocytes cell line HaCaT, mouse embryonal stem cell line mES and mouse embryonal fibroblast cell line STO. The cell-lines RAW 264.7, HMEC-1 and HaCaT were transfected by BIIluc plasmid using electroporation. The BIIluc plasmid carries a promotor for NF-κB and luciferase reporter gene. In order to detect the activity of NF-κB the RAW 264.7 cells were stimulated by LPS, the HMEC-1 and HaCaT cells were stimulated by TNF-α. The successful transfection and the activation of the NF-κB was documented by increased luciferase activity in cell lysates of all these cell lines. The mES and STO cell-lines were transfected by lipofection by plasmid carrying reporter gene for green fluorescent protein under control of cytomegalovirus promoter. Further these cell lines were transfected by RARE-Luc plasmid, which carries a promotor for a retinoid response element controlling expression of reporter luciferase gene. Effectiveness of tranfection was documented by increase of the green fluorescent protein presence inside of cells as was determined by flowcytometry. Further, seposivness of these cell lines to retinoic acid was confirmed by increase of luciferase activity in cell lysates. In conclusion, the electroporation and the liposome-mediated transfection were confirmed to be suitable for transfection of selected mammalian cell-lines. Plasmids carrying reporter genes under control of different promotor sequences appeared to be a highly valuable methodical approach for detection of activation of selected promoter regions.

Klíčová slova

transfekce, elekrtoporace, lipofekce, reportérové systémy, luciferasová aktivita, GFP, NF-κB

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 5. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 6. 2009
• Vedoucí: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie