Kinetický mechanismus NanoLuc luciferázy

Bc. Vojtěch Orel

Master's thesis

Kinetic mechanism of NanoLuc luciferase

Abstract:

Luciferázy se v poslední době stávají předmětem mnoha výzkummných studií pro svou unikátní vlastnost enzymatické produkce světla. V přírodě se vyskytuje mnoho luciferáz, avšak pouze zlomek je využitelný v biotechnologiích. Před deseti lety byla vyvinuta robustní NanoLuc luciferáza (Hall et al., Promega) spolu s umělým substrátem furimazinem (FMZ). NanoLuc si však zachoval enzymatickou aktivitu i s přírodním luciferinem koelenterazinem (CLT). Zůstává však neobjasněno, proč Nanoluc katalyzuje bioluminiscenci CLT a FMZ s tak rozdílnou katalytickou účinností. Intenzivní výzkum na poli strukturní biologie Nanolucu poskytl pouze limitované poznatky. Cílem této práce je rozluštit kinetický mechanismus NanoLuc luciferázy se dvěma rozdílnými luciferiny, k čemuž používáme metody tranzitní enzymové kinetiky a globální kinetické analýzy. Naše výsledky ukazují, že Nanoluc produkuje jeden produkt při bioluminiscenci s FMZ, ale vícero produktů při použití CLT. Dále jsme prokázali mechanismus pravděpodobné produktové inhibice jedním z vedlejších produktů. Naše výsledky v budoucnu poslouží jako podklady pro proteinové inženýrství nové generace luciferáz s trvanlivou, intenzivní a jasnou bioluminiscencí, kterou je možné využit v biotechnologiích.

Abstract:

Recently, there has been wide interest in the research of luciferases, which are enzymes with a unique ability to produce light. There are many luciferases, but only a few of them are applicable in biotechnology. A decade ago Hall et al. from Promega Corporation developed NanoLuc, a robust luciferase that functions with an artificial furimazine substrate (FMZ), but retains activity with a native coelenterazine luciferin (CLT). However, the precise mechanism by which NanoLuc catalyzes FMZ with significantly higher efficiency than CLT remains unclear. A considerable amount of research has been invested in structural studies of NanoLuc, but they brought only limited mechanistic insights. The purpose of this study is to elucidate the mechanism of NanoLuc catalysis with two different luciferins. We take advantage of transient enzyme kinetics combined with global kinetic analysis to decipher the kinetic model of catalysis. Our results indicate that NanoLuc creates a single molecular product from FMZ, but multiple products from CLT. Our study proposes a detailed mechanism of possible product inhibition by the side product of CLT. Our findings may provide an essential basis for protein engineering of next-generation luciferases with long-lasting, bright, and intense bioluminescence applicable in biotechnology.

Keywords

Bioluminiscence, Katalýza, Enzymy, NanoLuc, Luciferáza, Furimazin, Koelenterazin, Enzymová kinetika, Tranzitní kinetika, Kinetický mechanismus, Bioluminescence, Catalysis, Enzymes, Luciferase, Furimazine, Coelenterazine, Enzyme kinetics, Transient kinetics, Kinetic mechanism

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2024
• Supervisor: prof. RNDr. Zbyněk Prokop, Ph.D.
• Reader: Mgr. Vojtěch Sedláček, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry