The receiver domain of sensor histidine kinase CKI1: biochemical and structural characterization

Mgr. Petra Borkovcová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Proces přenosu signálu v rostlinách je zprostředkováván tzv. vícesložkovým signálním systémem. Zatímco signální systémy bakterií vykazují přísnou specifitu, rostlinný systém byl na základě dosavadních dat, získaných z genetických analýz a analýz protein-proteinových interakcí považován za nespecifický a některé jeho složky se zdály nadbytečné a mezi sebou zaměnitelné. Jedním z proteinů, zapojených v tomto přenosu signálu u rostlin je hybridní histidinkináza CKI1. Ačkoli její vstupní signál zatím není znám, bylo zjištěno, že CKI1 je zásadní v procesech vývoje cévních svazků, regulace vegetativního růstu a megagametogeneze. Na základě sekvenčních analýz jsme specifikovali část proteinu, C-koncovou přijímačovou doménu (RD), vhodnou pro plánovanou strukturní a biochemickou charakterizaci. Tato přijímačová doména fosoforyluje následné členy signalizační dráhy, přenašeče fosfátu (AHP). CKI1RD jsme exprimovali v bakteriálním systému Escherischia coli.a exprimovaný protein purifikovali do čistoty, vhodné pro krystalizaci a přípravu polyklonálních protilátek. Připravené anti-CKI1RD protilátky vykazovaly velmi dobrou specifitu i citlivost: in vitro a in situ detekovaly CKI1 bez křížových reakcí mezi ostatními vysoce příbuznými členy stejné histidinkinázové rodiny. Purifikovaný protein CKI1RD byl krystalizován metodou visící kapky. Zjištěná struktura CKI1RD (α/β)5 ukazuje příslušnost k proteinové rodině odvozené od CheY. Pro testování interakce CKI1RD s celkovou kolekcí šesti AHP jsme použili tří metod, bimolekulární srovnávací fluorescence, dvouhybridního kvasinkového systému a nepřímé ELISA. Zjistili jsme, že CKI1RD je právě tou částí celkového proteinu CKI1, která je odpovědná za specifické rozpoznávání a interakci s AHP a specificky reaguje se třemi z nich, a to dokonce s různou afinitou. Naše výsledky poprvé ukazují specifitu interakcí v signálním systému rostlin. Zjištění struktury CKI1RD bylo jedním z kroků k objasnění specifity MSP na molekulární úrovni.

Abstract:

Multistep phosphorelay signaling (MSP) pathways mediate a large spectrum of critical developmental processes in plants. Based on genetic and protein-protein interaction studies, a certain non-specificity of this system and redundancy of its components was proposed when compared with strictly specific archetypal two-component signaling pathways in prokaryotes. The hybrid histidine kinase CKI1 is sensor histidine kinase acting in MSP signaling. Although its input signal is not yet known, it has been shown to play a crucial role in megagametogenesis, vegetative growth and vasculature development. Using bioinformatics tools we predicted sequence encoding C-terminal receiver domain of CKI1 (CKI1RD), which was supposed to phosphorylate downstream members of the signaling pathway, the histidine-containing proteins (AHPs). CKI1RD was expressed in Escherichia coli and purified to give a highly pure target protein. The purified CKI1RD protein was then used as an antigen for polyclonal anti- CKI1RD antibody production. The resulting polyclonal antibodies revealed sensitivity and specificity sufficient to specifically distinguish CKI1, both in vitro and in situ, without cross-reactivity even with highly homologous members of the same HK family. The purified CKI1RD was further crystallized by the hanging-drop method and the structure of CKI1RD was determined. CKI1RD was shown to share (α/β)5 fold found in the CheY-like proteins superfamily. Using bimolecular fluorescence complementation and yeast two-hybrid assay we showed that CKI1RD is responsible for the recognition of the CKI1 downstream signaling partners, the AHPs, and specifically interacts with three of them with different affinities. These results show for the first time the specificity of plant MSP signaling. Determination of CKI1RD structure represents first important step in our further understanding to the structural determinants of the MSP specificity at atomic resolution.

Keywords

CKI1, přijímačová doména, polyklonální protilátky, imunoprecipitace, imunolokalizace, receiver domain, polyclonal antibodies, immunoprecipitation, immunolocalization

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 9. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 30. 9. 2014
• Supervisor: doc. RNDr. Jan Hejátko, Ph.D.
• Reader: Mgr. Vilém Reinöhl, CSc., Mgr. Lukáš Spíchal, PhD.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Genomics and Proteomics