Využití cytometrických metod k rozeznání mezidruhových hybridů jeseterů od jeseterů čistého druhu

Bc. Nikola TŘEŠŇÁKOVÁ

Master's thesis

Abstract:

Cílem této diplomové práce je porovnání obsahů DNA naměřených průtokovou a obrazovou cytometrií k rozeznání čistých jeseterovitých druhů ryb (Acipenser ruthenus, A. baerii, A. gueldenstaedtii) a uměle vytvořených mezidruhových F1 hybridů (A. ruthenus x A. baerii, A. baerii x A. ruthenus, A. baerii x A. gueldenstaedtii, A. gueldenstaedtii x A. baerii) pocházející z uzavřeného chovu Genetického rybářského centra VÚRH ve Vodňanech (FROV JU). K měření relativního obsahu DNA pomocí průtokové cytometrie (FCM) byly vzorky ploutevní tkáně barveny fluorescenčním barvivem DAPI (4,6-diamidin-2-phenylin-dolem). Výsledné hodnoty relativních obsahů DNA byly přepočítány na absolutní obsah DNA. Pro obrazovou cytometrii byla zvolena metoda Feulgenovy obrazové analýzy (FIA). Stanovení absolutního obsahu DNA touto analýzou proběhlo měřením IOD (integrované optické denzity) jader erytrocytů na připravených, uložených a dosud nezpracovaných krevních nátěrech. V tomto experimentu bylo testováno měření 20 postupně analyzovaných jedinců z každé skupiny/ populace, nešlo však o identické jedince testované oběma metodami současně. Proto je možné, že u některých skupin bylo zjištěno více ploidních úrovní metodou FCM než metodou FIA a naopak. Na základě získaných výsledků měření lze říci, že využití těchto cytometrických metod k rozeznání mezidruhových F1 hybridů jeseterů od jeseterů čistého druhu pouze na základě stanovení obsahu DNA, lze jen stěží. To bylo prokázáno statistickou analýzou, díky níž byl zjištěn průkazný rozdíl (p < 0,05) pouze mezi obsahy DNA odpovídající odlišné ploidní úrovni. Z toho vyplývá, že skupina, ať už mezidruhového hybrida nebo čistého druhu s relativně stejnou hodnotou obsahu DNA odpovídající stejné ploidní úrovni se od sebe navzájem statisticky neliší (p > 0,05), nezávisle na zvolené metodě měření. Stěžejním problémem bude pravděpodobně spontánní polyploidizace či mezidruhová hybridizace. Mezi metodami nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl (p > 0,05), a proto lze do jisté míry odmítnout hypotézu s podhodnocováním výsledků naměřených metodou FCM s fluorescenčním barvivem DAPI a následného přepočtu. Avšak je-li možné pro měření obsahů DNA v praxi metodu FCM - DAPI upřednostnit před časově náročnější metodu FIA, si žádá další výzkum. Především by bylo vhodné podobný experiment zopakovat, s doporučením zařadit do metodiky také průtokovou cytometrii s fluorescenčním barvivem propidium jodid, díky níž je možné přímo měřit absolutní obsah DNA. Následně pak tyto tři cytometrické metody podrobit statistické analýze.

Abstract:

The purpose of this master thesis is comparison of DNA content measured by flow cytometry and image cytometry to distinguish pure sturgeon species (Acipenser ruthenus, A. baerii, A. gueldenstaedtii) from artificial interspecific F1 hybrids (A. ruthenus x A. baerii, A. baerii x A. ruthenus, A. baerii x A. gueldenstaedtii, A. gueldenstaedtii x A. baerii) originating from Genetic Fisheries Centre, RIFCH in Vodnany (FFPW USB). The relative DNA content was measured by flow cytometry (FCM) with using fluorescent dye DAPI (4,6-diamidin-2-phenylin-dole). Fin tissue was used as a sample for this method. Consequently, results of measuring relative DNA content were converted to absolute DNA content. The representative method of image cytometry was a Feulgen image analysis (FIA). Blood samples were already prepared, stored but still unprocessed. Absolute DNA content was gained by measuring of IOD (integrated optical density) of erythrocyte nuclei. In this experiment, 20 individuals were consequently analysed from each group/ population. These individuals were not identical and not tested by both methods at the same time. Therefore, it is possible that more ploidy levels were detected by FCM method than by FIA method and vice versa. Based on the obtained results, it can be said that the use of these cytometric methods to distinguish interspecific hybrids from clear sturgeons species only based on measurement of DNA content is complicated. Due to statistical analysis, a significant difference (p < 0,05) was found only between DNA contents corresponding to different ploidy levels. It means, that groups with interspecific hybrids or group with pure species with the same or very similar DNA content corresponding the same ploidy level were not statistically different (p > 0,05) from each other, and it does not matter which cytometric method was used. The crucial factor will be probably spontaneous polyploidy or interspecific hybridization. Between methods, not any statistically significant difference (p > 0,05) was found. Therefore, one the one hand, the hypothesis of underestimating the results measured by the FCM method with the fluorescent dye DAPI and the subsequent recalculation can be to some extent rejected. On the other hand, if the FCM - DAPI method can be preferred to the more time-consuming FIA method for measuring DNA content in practice, further investigation is required. It is recommended to provide similar experiment again. Also flow cytometry with fluorescent dye propidium iodide (PI) will be applied because with this method is possible to measure directly absolute DNA content, and finally compare these three methods by statistical analysis.

Keywords

jeseter, mezidruhový hybrid, funkční ploidie, relativní obsah DNA, absolutní obsah DNA, průtoková cytometrie, obrazová cytometrie, propidium jodid (PI), 4, 6-diamidin-2-phenylin-dolem (DAPI), Feulgenova reakce

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 6. 2020

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Martin Flajšhans, Dr. rer. Agr.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Master programme / field:
Agricultural Specialization / Fishery and Protection of Waters