Použití metody magnetických separací pro izolaci a detekci mykobakterií z biologického materiálu

Mgr. Markéta Hušáková, Ph.D.

Disertační práce

The use of magnetic separation method for an isolation and detection of mycobacteria from biological material

Anotace:

Detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) z trusu a mléka pomocí qPCR je klíčovou strategií v nové generaci kontrolních programů paratuberkulózy. Včasná a spolehlivá detekce zvířat vylučujících MAP by měla pomoci efektivně identifikovat infikovaná zvířata a omezit přenos infekce v raných stádiích tak, aby byla zajištěna účinná kontrola paratuberkulózy. Cílem této disertační práce bylo porovnat metody izolace DNA a vyhodnotit účinnost izolace ze vzorků mléka a trusu uměle kontaminovaných MAP se zaměřením na moderní instrumentální automatické postupy izolace DNA založené na magnetické separaci. Zároveň byla porovnávána automatická a manuální verze magnetické separace a dva způsoby přípravy vzorku trusu. Komerčně dostupné DNA izolační kity byly nejdříve otestovány z hlediska jejich účinnosti izolace a vybrané kity dále použity pro experimenty automatické izolace na bázi paramagnetických částic a porovnány s manuální verzí každého kitu. Detekce jednokopiového elementu F57 byla provedena pomocí qPCR za účelem kvantifikace MAP a stanovení účinnosti izolace. Testované kity vykazovaly významné rozdíly v jejich účinnosti izolace DNA. Nejlepší výsledky byly pozorovány u adsorpční silikátové metody izolace kitu Blood and Tissue z mléka a kitu Zymo Research v případě vzorků trusu. Nejvyšší účinnosti izolace pro magnetickou separaci bylo dosaženo s kitem MagMAX u obou typů testovaných matric. Metody magnetické separace a adsorpční silikátové izolace použité v této práci představují často používané metody v mykobakteriální diagnostice.

Abstract:

Detection and quantification of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) from faeces and milk using qPCR is a key strategy in new generation of paratuberculosis control programmes. Timely and reliable detection of animals shedding MAP should help to effectively identify infected animals and limit infection transmission at early stages to ensure effective control of paratuberculosis. The aim of this dissertation thesis was to compare DNA extraction methods and evaluate isolation efficiency using milk and faecal samples artificially contaminated by MAP with a focus on modern instrumental automatic DNA isolation procedures based on magnetic separation. In parallel, an automatic and manual version of magnetic separation and two methods of faecal samples preparation were compared. Commercially available DNA isolation kits were evaluated, and the selected kits were used in a trial of automatic magnetic beads-based isolation and compared with the manual version of each kit. Detection of the single copy element F57 was performed by qPCR to quantify MAP and determine the isolation efficiency. The evaluated kits showed significant differences in DNA isolation efficiencies. The best results were observed with the silica column Blood and Tissue kit for milk and Zymo Research for faeces. The highest isolation efficiency for magnetic separation was achieved with MagMAX for both matrices. The magnetic separation and silica column isolation methods used in this study represent frequently used methods in mycobacterial diagnostics.

Klíčová slova

mykobakterie, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, magnetická separace, adsorpční silikátová izolace, účinnost izolace, paratuberkulóza, Johneho choroba, qPCR, F57, mycobacteria, magnetic separation, adsorption silica isolation, isolation efficiency, paratuberculosis, Johne´s disease

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 2. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 4. 2021
• Vedoucí: Mgr. Iva Slaná, Ph.D.
• Oponent: prof. MVDr. Alois Čížek, CSc., doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Molekulární a buněčná biologie a genetika / Molekulární a buněčná biologie a genetika