Biofunkcionalizace moderních materiálů pro afinitní separace a biokatalýzu

Mgr. Jana Srbová

Disertační práce

Biofunctionalization of modern materials for affinity separations and biocatalysis

Anotace:

Tato disertační práce se zabývá biofunkcionalizací vybraných moderních materiálů (nanovlákna a magnetické částice) pro účely bioafinitních separací v mikrofluidním uspořádání nebo pro podporu hojení ran nosičem s imobilizovanými proteolytickými enzymy. V první části práce je popsána biofunkcionalizace nově připravených magnetických částic proteolytickým enzymem trypsinem. Vazba trypsinu byla optimalizována a byla stanovena skladovací i operační stabilita bioaktivního nosiče. Enzym trypsin v tomto případě sloužil jako modelový biokatalyticky aktivní ligand, jehož přítomnost a aktivitu lze snadno monitorovat pomocí reakce s nízkomolekulárním chromogenním substrátem. Dále byl enzym trypsin vázán na nanovlákna připravená metodou elektrospinningu, která se po biofunkcionalizaci stala výchozím materiálem pro nový typ bioaktivního krytu ran vhodného pro proteolytické štěpení nekrotické tkáně a debridementu v ráně. Druhá část práce se zabývala povrchovou modifikací magnetických mikročástic polymerem poly(ethylenglykolem) (PEG). Tento inertní polymer zvyšuje biokompatibilitu nosiče a snižuje nespecifickou adsorpci proteinů a buněk na jeho povrch, zároveň i snižuje adhezi částic na vnitřní stěny mikrofluidních čipů. Je-li navíc použit derivát poly(ethylenglykolu) s vhodnými terminálními skupinami, je možné ho využít jako tzv. ?raménko? pro imobilizaci bioaktivních látek. Magnetické částice byly PEGylovány a poté biofunkcionalizovány specifickými anti-EpCAM protilátkami. Tento nosič byl použit pro imunomagnetický záchyt EpCAM-pozitivních buněčných linií (modelový systém pro cirkulující nádorové buňky) v mikrofluidním uspořádání. Dosažená účinnost záchytu buněk byla porovnávána s analogickým komerčně dostupným nosičem. Poslední část práce byla směřována k vývoji specifického imunosorbentu pro mikrofluidní záchyt modelového mikroorganismu, Salmonella Typhimurium, v mléčných výrobcích. Pro přípravu nosiče byly vybrány vhodné magnetické částice i protilátky. Po vazbě protilátek byla ve vsádkovém uspořádání ověřena schopnost nosiče selektivně a účinně separovat cílové bakterie z mléka. Následně byla optimalizována technika imunomagnetického záchytu v mikrofluidním čipu ? magneticky stabilizovaném fluidním loži.

Abstract:

This Ph.D. thesis deals with the biofunctionalization of selected modern materials (nanofibers and magnetic microspheres) for the purposes of bioaffinity separations in microfluidic systems or the promotion of wound healing using a carrier with immobilized proteolytic enzymes. In the first part of the thesis the magnetic microspheres were biofunctionalized with proteolytic enzyme trypsin. Method for trypsin immobilization was optimized, and storage as well as operational stabilities of the prepared bioactive carrier were monitored. Here the enzyme trypsin served as a model biocatalytic ligand whose presence and activity can be easily followed by reaction with a low molecular-weight chromogenic substrate. Enzyme trypsin was also immobilized on the electrospun nanofibers with the aim to prepare a new type of bioactive wound dressing for enhanced proteolytic cleavage of necrotic tissue, i.e. enzymatic wound debridement. The second part of the thesis deals with the surface modification of magnetic microspheres with the inert polymer poly(ethylene glycol) (PEG). Generally PEG increases the biocompatibility of carriers and decreases the nonspecific adsorption of proteins and cells. At the same time, it reduces the carrier´s adhesion on the inner walls of microfluidic chips. Moreover when a PEG derivative with suitable terminal groups is immobilized it can be also utilized as a spacer for subsequent binding of bioactive ligands. Here magnetic microspheres were PEGylated and biofunctionalized with specific anti-EpCAM antibodies. The carrier was applied for microfluidic immunomagnetic separation of EpCAM-positive cell lines (model system for circulating tumour cells). The capture efficiency of cells was compared with the results achieved with the analogous commercial carrier. The last part of this thesis was intended to the development of specific immunosorbent for microfluidic immunocapture of a model microorganism, Salmonella Typhimurium, in dairy products. Both magnetic particles and the anti-Salmonella antibodies were thoroughly selected. After antibodies´ immobilization the selectivity and the efficiency of the carrier were tested in milk. Finally, this technique was adapted to microfluidic chip ? magnetically stabilized fluidized bed.

Klíčová slova

Biofunkcionalizace, imobilizace, bioafinitní separace, biokatalýza, magnetické částice, nanovlákna, mikrofluidika

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 9. 2015

Zveřejnit od: 31. 12. 2999

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 23. 10. 2015

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Doktorský studijní program / obor:
Analytická chemie / Analytická chemie