Detekcia fosforylácie vybraných proteínov pomocou dvojrozmernej polyakrylamidovej elektroforézy a imunoblotovania

Dávid LUKÁČ

Bakalářská práce

Detection of protein phosphorylation using two-dimensional polyacrylamide electrophoresis and immunoblotting.

Anotace:

Mitogénom aktivované proteínkinázy sa zúčastňujú signalizačných procesov v eukaryotických bunkách. Mitogénom aktivovaná proteínkináza 3 (MPK3) je dôležitou kinázou pri obrane rastliny voči biotickému a abiotickému stresu. Fosfolipázy sú enzýmy, ktoré hydrolyzujú štruktúrne fosfolipidy na kyselinu fosfatidovú a voľné molekuly cholínu. Fosfolipáza D1 (PLD1) je enzým, ktorý hrá úlohu počas obrany rastlín voči stresu zo sucha, poraneniu, hyperosmotickému stresu a stresu z napadnutia patogénmi. V predloženej bakálarskej práci sme sa zaoberali analýzou fosforylácie PLD1 a MPK3 v kontrolných podmienkach a podmienkach stresu zo sucha pomocou dvojrozmernej elektroforézy a imunoblotovania a pomocou Phostag technológie. Fosforyláciu MPK3 sme detekovali použitím dvojrozmernej polyakrylamidovej elektroforézy a imunoblotovania. Detekcia fosforylácie PLD1 bola uskutočnená pomocou Phostag technológie. Naše výsledky naznačujú možnú úlohu MPK3 vo fosforylácii PLD1. Mutantné rastliny A. thaliana pld1-1 a pld1-2 ukázali vyššiu citlivosť na stres zo sucha ako rastliny divého typu. Kombinácia dvojrozmernej elektroforézy a imunoblotovania sa javí ako efektívna metóda pre analýzu fosforylácie MPK3, pričom pre analýzu fosforylácie PLD1 je viac citlivá Phostag technológia.

Abstract:

Mitogene activated protein kinases are involved in signalization processes in eukaryotic cells. Mitogene activated protein kinase 3 is important during plant defense against biotic and abiotic stress. Phospholipases are enzymes hydrolyzing structural phopsholipids to phosphatidic acid cholin as free molecule. Phospholipase D1 is enzyme having role in plant defense against drought stress, hyperosmotic stress, as well as biotic stress. Present bachelor thesis aims to detect phosphorylation of PLD1 and MPK3 in control and drought stress conditions using two-dimensional polyacrylamide electrophoresis and imunoblotting as well as Phostag technology. We detected double phoshorylation of MPK3 using two-dimensional polyacrylamide electrophoresis combined with imunoblotting. We also detected PLD1 phosphorylation using Phostag technology. Our results also point to possible role of MPK3 in PLD1 phosphorylation during drought stress. Finally, mutant plants of A. thaliana pld1-1 and pld1-2 exerted more sensitivity to drought stress compared to wild type plants. Combination of two-dimensional polyacrylamide electrophoresis and imunoblotting with Phostag technology allowed us to detect chosen proteins in control and stress conditions, which make these methods effective in detecting phosphorylation of chosen proteins. In conclusion, two-dimensional polyacrylamide electrophoresis combined with imunoblotting appears as feasible method for analysis of MPK3 phosphorylation, while Phostag technology is more effective in determination of PLD1 phosphorylation.

Klíčová slova

MPK3, PLD1, dvojrozmerná elektroforéza, fosforylácia, stres zo sucha, imunoblotovanie

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 5. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Tomáš Takáč, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Biotechnologie a genové inženýrství