Comparative studies on Treponema pallidum: comparative genomics of yaws agents and phenomics of BAC clones of syphilis agent

Mgr. Bc. Darina Čejková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Druh Treponema pallidum zahrnuje obligátní lidské patogeny, jež mají podobnou velikost genomu a vysokou sekvenční homologii. Poddruh pallidum (TPA) je původcem sexuálně přenosné syfilis, poddruh pertenue (TPE) způsobuje nevenerické tropické onemocnění yaws a poddruh endemicum (TEN) způsobuje nevenerickou endemickou syfilis. Opičí izolát Fribourg-Blanc, který řadíme k TPE kmenům, způsobuje onemocnění podobné yaws u paviánů. Mezi další blízce příbuzná treponemata patří T. paraluiscuniculi a T. paraluisleporis, původce králičí a zaječí venerické syfilis. Všechna výše zmíněná treponemata nelze kultivovat v podmínkách in vitro a jsou považována za (nekultivovatelná) patogenní treponemata. Ačkoliv jednotlivá patogenní treponemata nelze od sebe morfologicky ani sérologicky rozeznat, klinická manifestace jednotlivých onemocnění je značně odlišná. Metoda whole genome fingerprinting (WGF) potvrdila více než 99,5% sekvenční identitu mezi poddruhy TPA a TPE. Žádné rozsáhlé inzerce, delece či chromozomové přestavby nebyly touto metodou objeveny. Lze tedy předpokládat, že rozdílná patogenita je způsobena pouze malými genetickými změnami. Aby bylo možné identifikovat tyto malé genetické změny mezi TPE a dalšími poddruhy, tři zástupci poddruhu TPE (Samoa D, CDC-2 a Gauthier) byly podrobeny vysoce kvalitní celogenomové sekvenaci. Výsledné genomové sekvence byly získány s použitím alespoň dvou sekvenačních technik „nové generace“ (next-generation sequencing), technikami komparativního genomového sekvencování, 454 pyrosekvencování nebo sekvencování metodou Illumina. Paralogní oblasti, nejednoznačně určené nukleotidy a mezery mezi kontigy byly sekvencovány dideoxyterminátorovou metodou. Výsledné celogenomové sekvence byly ověřeny metodou WGF. Experimentálně získaný restrikční profil byl porovnán s restrikčním profilem získaným analýzou výsledné sekvence in silico. Tento postup neodhalil žádný rozdíl. Proto je možné předpokládat, že frekvence sekvenační chyby je nanejvýše 10-4. Genom kmene TPE Samoa D, který obsahuje 1139330 bp, byl sekvencován všemi třemi sekvenačními metodami nové generace, kdežto kmeny CDC-2 (1139744 bp) a Gauthier (1139441 bp) byly sekvencovány metodou 454 a Illumina. Aby bylo možné určit kompletní sekvenci kmene Gauthier, musela býti vyvinuta metoda Pooled Segment Genomic Sequencing. Chromozomální DNA kmene Gauthier byla amplifikována v překrývajících se oblastech. Vzniklé PCR produkty byly ekvimolárně smíchány a sekvencovány. Genom kmene TPE Samoa D byl anotován de novo za použití softwarů Glimmer3, FgenesB a GeneMark. Pro geny kódující proteiny s nezmámou funkcí byla stanovena minimální hranice 150 bp. Genome kmene Samoa D se sestává z 1125 genů, z nichž 54 je nepřekládáno (tyto geny kódují tRNA, rRNA a nekódující RNA). Kódující oblasti zaujímají 95,36 % délky genomu. Celkově byly anotovány 3 pseudogeny, 648 genů kódujících proteiny se známou funkcí, 141 genů kódujících konzervovavé hypotetické proteiny o neznámé funkci, 129 genů kódujících treponemální konzervovavé hypotetické proteiny a 147 genů kódujících hypotetické proteiny. Anotace kmene Samoa D byla použita jako předloha pro anotaci kmenů TPE CDC-2, Gauthier a TPA DAL-1. U obou dalších TPE kmenů byl zachován stejný počet anotovaných genů. Odlišný počet nukleotidů v homopolymerních repeticích způsobil v genomu CDC-2 posunovou mutaci ve 2 genech, které byly reanotovány. V genomu Gauthier bylo reanotováno celkem 10 genů, včetně 9 genů s mutací způsobující posun čtecího rámce (6 z nich se nacházelo v oblasti homopolymerních repetic) a mutaci ve stop kodonu. Celkem 16 genů bylo reanotováno u kmene TPA DAL-1, včetně 14 genů s mutací způsobující posun čtecího rámce (sedm z nich se nac

Abstract:

házelo v oblasti homopolymerních repetic), 2 genů se shluky mnohočetných změn, 2 genových lokusů anotovaných jako 4 geny (oba lokusy byly anotovány jako 2 geny) a 5 genů, které byly zkráceny či prodlouženy v závislosti na manuální anotaci. Nejvyšší vnitrokmenová a mezikmenová variabilita mezi zástupci poddruhu TPE byla pozorována v oblasti tpr (Treponema pallidum repeat) genů, jež jsou považovány za geny kódující virulenční faktory. Největší vnitrokmenová heterogenita byla prokázána v genu tprK (TPE_0897), naopak gen tprD (TPE_0131) vykazoval největší variabilitu mezi kmeny. Vysoká mezikmenová i vnitrokmenová variabilita byla sledována nejenom uvnitř tpr genů, ale také v několika oblastech s variabilním počtem nukleotidů uvnitř homopolymerní repetice. Nalelzené indely v těchto oblastech mohou mít za následek posunovou mutaci či rozdílnou regulaci genové exprese. Pouze v kmeni Gauthier byly objeveny další mutace, které způsobují posun čtecího rámce u celkově tří genů. Gen TPEGAU_0856a kóduje hypotetický protein a geny TPEGAU_0629 a TPEGAU_0858 kódují treponemální konzervované hypotetické proteiny. U všech vyšetřených TPE kmenů byl popsán rozdílný počet tandemových repetic, které nezpůsobují posun čtecího rámce. Počet 60bp tandemových repetic genu arp (TPE_0433 kódujícího acidic repeat protein) kolísá mezi 4 a 12, počet 24bp tandemových repetic genu TPE_0470 (konzervovaný hypotetický protein) se nachází v rozmezí 12 a 37 a počet 9bp tandemových repetic genu TPE_0967 (treponemální konzervovaný hypotetický protein) alternuje mezi dvěmi a čtyřmi repeticemi. Dva další indely, které nezapříčinily posun čtecího rámce, byly identifikovány v genech TPE_0067 (protein, který se účastní buněčného dělení) a TPE_0136 (protein vnější membrány). Oba deletované úseky byly ohraničeny přímými repeticemi. Navíc gen TPE_0136 nese další jednonukleotidové záměny. V rámci poddruhu TPE byly nalezeny tři geny pod pozitivním selekčním tlakem. Jsou to: tp92 (TPE_0326, protein vnější membrány, povrchový antigen Tp92), gen mcp2 (TPE_0488, protein, který se účastní chemotaxe) a TPE_0548 (treponemální konzervovaný hypotetický membránový protein). Je tedy možné, že tyto geny kódují virulenční faktory poddruhu TPE. Některé z identifikovaných změn mezi TPE kmeny se mohou stát vhodnými kandidáty pro molekulární diagnostiku a epidemiologickou typizaci. Operony s geny kódující ribozomální RNA (rrn) byly vyšetřeny ve 20 kmenech nekultivovatelných patogenních treponemat, včetně 11 kmenů poddruhu TPA, 5 kmenů poddruhu TPE, 2 kmenů poddruhu TEN, opičího izobátu Fribourg-Blamc a králičího zástupce druhu T. paraluiscuniculi. Každý vyšetřený kmen obsahoval 2 rrn operony, které se lišily v oblasti 16S-23S ribozomálního intergenového mezerníku. Tento mezerník obsahuje jeden gen kódující tRNA, a to buď gen pro alanin-tRNA nebo gen kódující izoleucin-tRNA. Oba geny pro tRNA jsou vždy přítomny v genomu, mění se tedy jejich lokalizace. Pokud pomineme geny kódující odlišné tRNA produkty, pouze jedna delece předcházející genu pro 16S rRNA a dalších 17 heterologních nukleotidů byly nalezeny v rrn operonech treponemálních kmenů. Struktura konzervovaných a heterologních oblastí rrn operonu odpovídala klasifikaci treponemálních kmenů. Nicméně odlišná lokalizace genů pro tRNA (vzorec Ile/Ala nebo Ala/Ile) se zdá býti náhodná navzdory druhové a poddruhové klasifikaci, času a místa původu izolátů. Oblast 16S-23S ribozomálního intergenového mezerníku byla dále ještě vyšetřena u 30 klinických izolátů (pocházejících z České republiky), které náležely do pěti odlišných genotypů. Všechny klinické izoláty obsahovaly stejný vzorec (Ile/Ala), kdy gen pro izoleucin-tRNA byl lokalizován v rrn1 a gen pro alalnin-tRNA byl umístěn v rrn2 operonu. Reciproká translokace rrn operonů je pravděpodobně zajištěna rekombinačním mechanizmem, který je podobný mechanizmu dráhy recBCD. Nejmenší sada (19 klonů) BAC knihovny kmene TPA Nichols byla podrobena testům zkoumajícím rozličné fenotypové projevy. Celkově bylo provedeno 1342 paralelních testů; 190 substrátů bylo testováno jako jediných zdroj uhlíku, 192 testů sledovalo citlivost bakterií k různému pH a osmotického prostředí a 960 testů prověřovalo rezistenci k antibiotikům. Tři klony BAC knihovny vykazovaly zvýšenou rezistenci. Klon DSTP001 byl více rezistentní k lincomycinu a cefalosporinům, klon DSTP334 vykazoval zvýšenou rezistenci k antibiotikům cinoxacin a 2,4-diamino-6,7-diisopropyl-pteridin, klon DSTP094 byl více rezistentní k antibiotikům guanazol a D,L-serin hydroxamát. Konkrétní treponemální geny, které zvyšují odolnost hostitelské Escherichia coli k výše zmíněným antibiotikům, je nutné určit.

Abstract:

The species Treponema pallidum includes several obligate human pathogens with similar genome sizes and a high degree of sequence similarity. The subspecies pallidum (TPA) is an agent of sexually transmitted syphilis, the subspecies pertenue (TPE) causes non-venereal tropical disease yaws, and the subspecies endemicum (TEN) causes non-venereal endemic syphilis. In addition to human pathogens, the simian Fribourg-Blanc strain, clustering within the TPE group, causes a yaws-like disease in baboons. Other closely related treponemes include T. paraluiscuniculi and T. paraluisleporis, the agents of rabbit and hare venereal disease, respectively. All these organisms cannot be continuously cultivated in vitro and they are considered as non-cultivable pathogenic treponemes. The diseases caused by these treponemes are quite distinct, although the pathogens are microscopically and serologically indistinguishable, being >99.5% identical based on the whole genome fingerprinting (WGF) results. These results showed that no major gene deletions, insertions or rearrangement are present among pathogenic treponemes. Relatively subtle genetic differences are thus responsible for different pathogenicity and host range. To precisely define genetic differences between TPE and other subspecies, high quality whole genome sequences of three TPE strains (Samoa D, CDC-2, Gauthier) were determined by a combination of several next-generation sequencing techniques, including Comparative Genome Sequencing, 454 pyrosequencing and Illumina techniques. Paralogous regions, ambiguous bases and gaps were resolved using dideoxy-terminator sequencing. To verify the final genome assemblies, the WGF was compared to the in silico restriction enzyme analysis of each sequenced TPE genome. No discrepancies between in silico and experimental restriction site analyses of TPE genomes were found, thus estimating a sequencing error rate to be lower than 10-4. The TPE Samoa D genome, comprising 1,139,330 bp, was sequenced by all three next-generation sequencing techniques mentioned above, while CDC-2 (1,139,744 bp) and Gauthier (1,139,441 bp) genomes were determined by 454 and Illumina approaches. To determine the Gauthier genome sequence, a pooled segment genomic sequencing method needed to be developed. Briefly, chromosomal DNA was amplified in overlapping segments and equimolar PCR products were pooled and sequenced. The TPE Samoa D genome was annotated de novo using Glimmer3, FgenesB and GeneMark software. For genes with unknown function, a gene size limit of 150 bp was applied. The genome consists of 1125 genes, including 54 untranslated genes (coding for rRNAs, tRNAs and other non-coding RNAs). The coding regions comprise 95.36% of the genome length. In total, 3 pseudogenes, 648 genes encoding proteins with predicted function, 141 genes encoding conserved hypothetical proteins, 129 genes encoding treponemal conserved hypothetical proteins, and 147 genes encoding hypothetical proteins were annotated. The TPE Samoa D gene annotation was used as a scaffold for the TPE CDC-2 and Gauthier, and TPA DAL-1 annotation. The same number of genes was preserved in both CDC-2 and Gauthier TPE strains. Two genes were re-annotated in the CDC-2 genome due to frameshuft mutation caused by different number of homopolymers within homopolymeric strings. In total, 10 genes were re-annotated in the Gauthier genome, 9 genes due to grameshift mutation (6 within homopolymeric tract) and one gene with a mutation in the stopcodon. In total, 16 genes needed to be re-annotated in the TPA DAL-1 strain, including 14 genes carrying a frameshift mutation (7 within homopolymeric tract) and 2 genes with a cluster of multiple mutations. As a consequence, 4 Samoa D orthologues were not annotated, 5 genes were considered pseudogenes, 2 gene loci were annotated as 4 genes (each locus was split into 2 genes) and 5 genes were truncated or elongated based on manual prediction. The major intra- and inter-strain

Abstract:

variability among TPE strains was observed within tpr (Treponema pallidum repeat) genes, genes coding for putative virulence factors. Whereas tprK (TPE_0897) gene showed the highest intra-strain heterogeneity, the tprD (TPE_0131) gene showed the highest heterogeneity between strains. In addition to high variability observed in tpr genes, different numbers of nucleotides within several homopolymeric strings were revealed between and within TPE strains. Indels within homopolymeric strings can result in frameshift mutation or different gene expression. Additional frameshift mutations were observed only in the Gauthier strain, affecting three genes coding for hypothetical (TPEGAU_0856a) or treponemal conserved hypothetical proteins (TPEGAU_0629, TPEGAU_0858). Among all examined TPE strains, three genes with variable number of tandem repeats do not disrupt an open reading frame. The number of 60-bp tandem repeat in the arp gene (TPE_0433 encoding acidic repeat protein) varies between 4 and 12, the number of 24-bp tandem repeats in TPE_0470 (conserved hypothetical protein) is between 12 and 37, and the number of 9-bp tandem repeats in TPE_0967 (treponemal conserved hypothetical protein) alternates between two and four. Two other indels, preserving the open reading frames, were identified in TPE_0067 (cell division protein) and TPE_0136 (outer membrane protein). Interestingly, the deleted loci were terminated by direct repeats. Moreover, TPE_0136 harbors additional single nucleotide mutations. Within TPE strains, three genes were found to be under positive selection, including tp92 (TPE_0326, outer membrane protein), mcp2 (TPE_0488, methyl-accepting chemotaxis protein) and TPE_0548 (treponemal conserved hypothetical membrane protein). These genes likely encode virulence factors or antigens. The identified changes that are specific to individual strains represent suitable targets for molecular diagnostics and epidemiologic typing. The rrn operons were examined in 20 strains of non-cultivable pathogenic treponemes, including 11 strains of TPA, 5 strains of TPE, 2 strains of TEN, a simian Fribourg-Blanc and a rabbit T. paraluiscuniculi strain. Every examined strain carries 2 rrn operons, each with a different 16S-23S ribosomal intergenic spacer, containing a gene encoding either tRNA-Ala or tRNA-Ile. With the exception of genes coding for tRNAs, only a deletion upstream of the 16S rDNA and additional 17 heterogenous nucleotide positions were found within the rrn operons among treponemal strains. The sequence of the rrn operons reflects the classification, while different rrn spacer patterns (Ile/Ala and Ala/Ile) appeared to be randomly distributed across the species/subspecies classification, time, and geographical source of the treponemal strains. Moreover, 16S-23S ribosomal intergenic spacers were determined for 30 clinical samples (of the Czech Republic origin) belonging to 5 different genotypes. All clinical samples showed the Ile/Ala pattern. The reciprocal translocation of genes coding for tRNA is likely mediated by a recBCD-like recombination pathway. A minimal set (19 clones) of the BAC library of TPA Nichols DNA was tested under 1342 different phenotype conditions. Overall, 190 substrates were tested as sole carbon sources and 192 pH and osmotic sensitivity and 960 antibiotic resistance assays were performed. An increased resistance to lincomycin and cephalosporins was observed in the DSTP001 clone, resistance to cinoxacin and 2,4-diamino-6,7-diisopropyl-pteridine in the DSTP334 clone, and resistance to guanazole and D,L-serine hydroxamate in the DSTP094 clone when compared to other clones and the host E. coli strain. The treponemal genes causing the higher resistance of these BAC clones need to be further examined.

Keywords

Treponema pallidum, yaws, syfilis, komparativní genomika, rrn operon, fenotypový microarray, sekvencování nové generace, comparative genomics, phenotype microarray, next-generation sequencing

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 11. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 7. 12. 2012
• Supervisor: prof. MUDr. David Šmajs, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Biology (4-years) / Medical Biology