Studium lektinů z patogenních organismů

Mgr. Petra Sýkorová, Ph.D.

Disertační práce

Study of lectins from pathogenic organisms

Anotace:

Lektiny jsou proteiny, které specificky a reverzibilně vážou sacharidy. Tyto proteiny jsou zastoupeny v celé přírodě a na rozdíl od protilátek nejsou produktem imunitní odpovědi. Typická je jejich schopnost aglutinovat a precipitovat erytrocyty, což se využívá k jejich detekci. Sacharidové struktury umístěné na buněčném povrchu slouží jako rozpoznávací místa mezi patogenní bakterií a hostitelskou buňkou. Toto rozpoznávání zprostředkované sacharidy hraje důležitou roli ve schopnosti patogenních bakterií adherovat na povrch hostitelské buňky během první fáze infekce hostitele. Funkční studie lektinů by mohly objasnit jejich biologickou úlohu v interakcích hostitel-mikroorganismus a mohly by být použity v potenciální antiadhezivní terapii bakteriálních onemocnění. V rámci této dizertační práce byly studovány lektiny ze tří bakterií a to z patogenu člověka Burkholderia pseudomallei, patogenu hmyzu Photorhabdus luminescens a patogenu rostlin Ralstonia solanacearum. Bakterie Photorhabdus luminescens je v mutualistickém soužití s entomopatogenními hlísticemi rodu Heterorhabditis. Tyto hlístice infikují hmyz v larvárním stadiu a uvolňují bakterie do hemolymfy. Poté zabitý hmyz slouží jako zdroj potravy vhodný pro růst a vývoj hlístic. Protein PLU z P. luminescens vykazuje významnou sekvenční podobnost s charakterizovaným lektinem BC2L-C-nt z lidského oportunitního patogenu Burkholderia cenocepacia. Gen kódující lektin PLU byl klonován a úspěšně byly nalezeny podmínky exprese genu a purifikace. Pro detekci aktivity lektinu byla použita rezonance povrchového plazmonu a hemaglutinace. Předběžná informace o kvarterní struktuře proteinu byla získána pomocí metod dynamického rozptylu světla a analytické ultracentrifugace. Pro pochopení interakce P. luminescens s hmyzími hemocyty byla studována interakce hemocytů s lektinem. Výsledky ukázaly, že lektin PLU se váže na hemocyty a vede k aglutinaci buněk. V bakteriální kultuře P. luminescens byl objeven další lektin a pojmenován PLL. Rezonance povrchového plazmonu a hemaglutinace ukázaly, že nativní lektin váže L-fukosu a methyl-α,L-fukosid. Struktura proteinu je tvořena sedmilopatkovým barelem seskládaným z β-listů. Analýza MALDI-TOF MS ukázala, že protein je přítomen v roztoku jako tetramer, což bylo potvrzeno také krystalovou strukturou. Bakterie Burkholderia pseudomallei je lidský patogen způsobující febrilní onemocnění zvané melioidóza, která je endemická ve východní Asii a v severní Austrálii. Patogen se nachází v kontaminované vodě a půdě. Vzhledem k neobvyklé rezistenci bakterií vůči antibiotikům je léčba často velmi problematická a úmrtnost na infekce je vysoká. Byl identifikován nový lektin z B. pseudomallei, který nevykazoval žádnou významnou sekvenční podobnost se známými proteiny. Gen kódující lektin byl klonován a podmínky exprese genu a purifikace proteinu byly úspěšně optimalizovány. Pro charakterizaci interakcí mezi lektinem a sacharidy byla použita rezonance povrchového plazmonu a titrační mikrokalorimetrie. Obě metody odhalily schopnost lektinu vázat D manosu a manosylované deriváty. Struktura proteinu byla vyřešena za použití rentgenové difrakce a byla zjištěna struktura sedmilopatkového barelu seskládaného z β-listů. Lektin je přítomen jako monomer v roztoku i v krystalové struktuře. Ralstonia solanacearum je bakteriální patogen, který je hlavním omezujícím faktorem při produkci mnoha plodin po celém světě. V minulosti charakterizovaný lektin RSL z R. solanacearum má trimerní strukturu z šestilopatkového β-skládaného listu a vykazuje významnou podobnost s monomerní jednotkou dimerního lektinu AAL z Aleuria aurantia. Olausson a kol (Linköping, Švédsko) připravili monomer AAL a monovalentní fragment AAL. Obě formy protein

Anotace:

u si zachovaly svou schopnost vázat fukosylované oligosacharidy, ale lišily se v některých vlastnostech od intaktního rekombinantního lektinu AAL. Analogicky jsme připravili monovalentní a monomerní formu RSL. Připravené formy RSL však nevykazovaly žádné vazebné vlastnosti. Pravděpodobně tyto úseky proteinu nemohly být správně sbaleny.

Abstract:

Lectins are proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates. These proteins are represented in the whole nature and unlike antibodies they are not the product of an immune response. Typical is their ability to agglutinate and precipitate erythrocytes, which is used for their detection. The carbohydrate structures located on the cell surface serve as recognition sites between a pathogenic bacterium and a host cell. This carbohydrate-mediated recognition plays an important role in the ability of pathogenic bacteria to adhere to the surface of the host cell during the first phase of their infection of the host. The functional studies of lectins should clarify their biological role in host-microorganism interactions and could be used in potential anti-adhesive therapy of bacterial diseases. In this PhD thesis, lectins from three bacteria were studied, namely from the pathogen of human Burkholderia pseudomallei, the pathogen of insect Photorhabdus luminescens and the pathogen of plant Ralstonia solanacearum. The bacterium Photorhabdus luminescens is mutualistically associated with entomopathogenic nematodes from the genera Heterorhabditis. These nematodes infect the insect in larvae stage and release the bacteria into hemolymph. Afterwards, killed insect serves as a food source suitable for nematode growth and development. The protein PLU from P. luminescens displays a significant sequence similarity with the characterized lectin BC2L-C-nt from the human opportunistic pathogen Burkholderia cenocepacia. The gene coding the lectin PLU was cloned and conditions of both the gene expression and protein purification were successfully found. For detecting lectin activity was used surface plasmon resonance and hemagglutination. Preliminary information about the quaternary structure of the protein was obtained using dynamic light scattering and analytical ultracentrifugation methods. For understanding how P. luminescens interacts with the insect hemocytes the interaction of hemocytes with lectin was studied. The results showed that PLU lectin binds to hemocytes and it leads to cell agglutination. Another lectin was discovered in the P. luminescens bacterial culture and named PLL. Surface plasmon resonance and hemagglutination showed that native lectin binds L fucose and methyl-α,L-fucoside. The protein structure consists of a seven-bladed β-propeller fold. MALDI-TOF MS analysis showed that the protein is present as a tetramer in solution which was confirmed by the crystal structure. The bacterium Burkholderia pseudomallei is a human pathogen causing febrile illness called Melioidosis which is endemic in East Asia and north Australia. The pathogen is found in contaminated water and soil. Due to unusual resistance of the bacteria to antibiotics the treatment is often very problematic and mortality rate of the infections is high. A new lectin from B. pseudomallei, which did not show any significant sequence similarity to the known proteins, was identified. The gene coding the lectin was cloned and conditions of gene expression and protein purification were successfully optimized. Surface plasmon resonance and titration microcalorimetry were used to characterize the interactions between the lectin and saccharides. Both methods revealed the lectin’s ability to bind D mannose and mannosylated derivatives. The structure of the protein was solved using X-ray diffraction and revealed seven-bladed β-propeller fold. The lectin is present as a monomer both in solution and in crystal structure. Ralstonia solanacearum is a bacterial pathogen that is a major limiting factor in the production of many crops worldwide. Recently characterised RSL lectin from R. solanacearum has a trimeric structure from a six-blade β-folded leaf and shows significant similarity to the monomer unit of the AAL dimer lectin from Aleuria aurantia. Olausson et al. (Linköping, Sweden) prepared AAL monomer and AAL monovalent fragment. Both forms of protein ret

Abstract:

ained their ability to bind fucosylated oligosaccharides but differed in some properties from the intact recombinant AAL lectin. Analogously, we prepared monovalent form and monomeric form of RSL. However, the prepared forms of RSL showed no binding properties. Probably these regions of the protein didn’t be properly folded.

Klíčová slova

lektiny, sacharidy, patogen, Photorhabdus luminescens, Burkholderia pseudomallei, lectins, saccharides, pathogen

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 28. 11. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 11. 12. 2019
• Vedoucí: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.
• Oponent: prof. RNDr. Petr Hodek, CSc., doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie