Zobrazení reaktivních forem kyslíku v lidských buňkách v reakci na abiotický stres

Alina OVSII

Bachelor's thesis

Imaging of reactive oxygen species in human cells in response to abiotic stress

Abstract:

The cell line U-937 is a pro-monocytic human myeloid leukaemia cell line which was isolated from histiocytic lymphoma patient. These cells are used to study the behaviour and differentiation of monocytes. Under the effect of abiotic stress, these monocytes are known to differentiate into macrophages or dendritic cells depending on the inducer used. The mature differentiated U-937 cells are characterized by an irregular shape, the presence of pseudopodia, and phagocytic activity. It has also been reported that during macrophage phagocytosis, reactive oxygen species (ROS) are formed, however, it has never been precisely characterized. In the current study, the cell differentiation was induced by using phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) which is a well-known protein kinase C (PKC) activator. The exogenous addition of PMA can activate nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen (NADPH) oxidase, which can lead to the formation of superoxide anion radical in the cell. Dismutation of superoxide anion radical leads to the formation of hydrogen peroxide, and subsequently, it can act as a predecessor for the creation of more lethal oxygen species such as hydroxyl radical. In this study, the peculiar morphology of mature macrophages has been investigated by confocal laser scanning microscopy as well as an effort has been made to localize the associated ROS formation, specifically hydrogen peroxide. The results were validated using electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy; protein modification caused by hydroxyl radical was confirmed by western blot. This thesis intends to broaden our understanding of ROS formation, localization, and its general characterization in U-937 cells.

Abstract:

U-937 je buněčná linie promonocytární lidské myeloidní leukémie, která byla izolována od pacienta s histiocytárním lymfomem. Tyto buňky se používají ke studiu chování a diferenciace monocytů. Je známo, že pod vlivem abiotického stresu se tyto monocyty diferencují na makrofágy nebo dendritické buňky v závislosti na použitém induktoru diferenciace. Zralé diferencované buňky U-937 se vyznačují plochým nepravidelným tvarem, přítomností pseudopodií a fagocytární aktivitou. Dřívější studie uváděly, že během fagocytózy makrofágů dochází ke vzniku reaktivních forem kyslíku (ROS), nikdy to však nebylo přesně charakterizováno. V současném studiu je diferenciace buněk indukovaná pomocí forbol-12-myristát-13-acetátu (PMA), což je dobře známý aktivátor proteinkinázy C (PKC). Exogenní přídavek PMA může aktivovat nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADPH) oxidázu, což může vést k tvorbě superoxidového aniontového radikálu v buňce. Dismutace superoxidového aniontového radikálu vede k tvorbě peroxidu vodíku a následně může působit jako předchůdce pro tvorbu reaktivnějších forem kyslíku, jako je hydroxylový radikál. Zvláštní morfologie zralých makrofágů byla zkoumána konfokální laserovou skenovací mikroskopií (CLSM) a také bylo vynaloženo úsilí na lokalizaci související tvorby ROS, konkrétně hydroxylového radikálu. Výsledky byly ověřeny pomocí spektroskopie elektronové paramagnetické rezonance (EPR); modifikace proteinů způsobená hydroxylovým radikálem byla potvrzena western blotem. Tato práce má za cíl rozšířit naše porozumění ohledně tvorby, lokalizace a obecné charakterizace ROS v buňkách U-937.

Keywords

Buňky U-937, reaktivní formy kyslíku, oxidační stres, monocyty, konfokální laserová skenovací mikroskopie.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 8. 2022

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Ankush Prasad, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Physics / Biophysics