Molekulární aspekty hormonálního působení cytokininů

Mgr. Jan Novák, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular aspects of hormonal regulation by cytokinins

Abstract:

Cytokininy jsou známy jako pozitivní regulátory vývoje prýtu rostlin. Navzdory tomu bylo v minulosti ukázáno, že exprese bakteriálního genu ipt, který kóduje enzym syntetizující cytokininy, vede k vadnutí rostlin a tvorbě lézí. Některé patogeny jsou známy svou schopností ovlivňovat hladiny cytokininů během napadení rostlin. Reakcí na útok patogena může být spuštění hypersenzitivní reakce, která vede k rychlému odumírání buněk v místech infekce. Tento proces limituje příjem živin patogenem a zároveň brání jeho dalšímu šíření. V této práci jsme se zabývali studiem procesů následujících po aktivaci exprese bakteriálního ipt až po tvorbu lézí s cílem ukázat cytokininy jako signál či mediátor interakcí mezi rostlinou a patogenem. Pro tyto účely byly užity transgenní rostliny s binárním systémem pOp-ipt/LhGR, který umožňuje na základě aplikace induktoru aktivovat expresi bakteriálního genu ipt a zvýšit tak endogenně hladinu cytokininů v rostlinách tabáku. Změny v hladinách cytokininů a dalších hormonů spojených se stresem byly po aktivaci ipt sledovány pomocí metody LC-MS. Změny v hladinách peroxidu vodíku a peroxidaci lipidů byly sledovány esejí s užitím jodidu draselného a esejí pro určení malondialdehydu. Buněčná lokalizace peroxidu vodíku byla určena barvením pomocí 3,3´-diaminobenzidinu. Dynamika hladiny transkriptů genů spojených s fotosyntézou a obranou rostlin proti patogenům byla stanovena pomocí metody qRT-PCR. Vliv cytokininů na fotosyntézu byl sledován na základě změn parametrů odvozených od fluorescence chlorofylu a průduchové vodivosti. Hladina glutationu byla určena esejí s užitím Ellmanova reagentu. Výsledky ukazují, že transgenní rostliny mohou produkovat vysoké hladiny cytokininů, které jsou následovány rychlou buněčnou smrtí bez zjevných známek chlorózy, což je velmi příbuzné hypersenzitivní reakci na útok patogenem. Vysoké hladiny cytokininů vedou ke zvýšení hladiny peroxidu vodíku, který významně reguluje procesy spojené s hypersenzitivní odpovědí jako jsou inhibice fotosyntézy, zvýšení hladiny stresových hormonů, oxidační poškození membrán a uzavírání stomat, které byly v této práci rovněž pozorovány. Rovněž je demonstrováno, že vysoké hladiny cytokininů vedou ke snížení hladiny glutationu, klíčové komponenty redoxního systému buněk. Rostliny mohou mít rovněž pozměněn redoxní stav buňky, což je demonstrováno snížením hladiny glutationu. Nekrotické léze formované po aktivaci ipt velmi silně připomínají hypersenzitivní odpověď v reakci na útok patogenů. Cytokininy tedy mohou působit jako signál či mediátor v oblasti obrany rostlin při napadení patogeny.

Abstract:

Cytokinins are positive regulators of shoot development. However, it was previously demonstrated that efficient activation of the cytokinin biosynthesis gene ipt can cause necrotic lesions and wilting in tobacco leaves. Some plant pathogens reportedly use their ability to produce cytokinins in disease development. In response to pathogen attacks, plants can trigger a hypersensitive response that rapidly kills cells near the infection site, depriving the pathogen of nutrients and preventing its spread. We investigated a diverse set of processes that link ipt activation to necrotic lesion formation in order to evaluate the potential of cytokinins as signals and/or mediators in plant defence against pathogens. For this purpose, the binary pOpipt/ LhGR system for dexamethasone-inducible ipt expression was used to increase endogenous cytokinin levels in transgenic tobacco. Changes in the levels of cytokinins and the stress hormones salicylic, jasmonic and abscisic acid following ipt activation were determined by LC-MS. Trends in hydrogen peroxide content and lipid peroxidation were monitored using the potassium iodide and malondialdehyde assays. The subcellular distribution of hydrogen peroxide was investigated using 3,3´-diaminobenzidine staining. The dynamics of transcripts related to photosynthesis and pathogen response were analyzed by reverse transcription followed by qRT-PCR. The effects of cytokinins on photosynthesis were deciphered by analysing changes in chlorophyll fluorescence and leaf gas exchange. The level of glutathione pool was monitored by assay with Ellman´s reagent. It is shown that plants can produce sufficiently high levels of cytokinins to trigger fast cell death without any intervening chlorosis – a hallmark of the hypersensitive response. Our results suggest that chloroplastic hydrogen peroxide orchestrates the molecular responses underpinning the hypersensitive-like response, including the inhibition of photosynthesis, elevated levels of stress hormones, oxidative membrane damage, and stomatal closure. Moreover, plants could have affected redox state as it is presented by decrease in glutathione pool. Necrotic lesion formation triggered by ipt activation closely resembles the hypersensitive response. Cytokinins may thus act as signals and/or mediators in plant defences against pathogen attack.

Keywords

Cytokininy, oxidační stres, patogen, Nicotiana tabacum

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 5. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 27. 6. 2013
• Supervisor: prof. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Jan Hejátko, Ph.D., Ing. Václav Motyka, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology