Využití telomerázy jako diagnostického a prognostického nádorového markeru

Ing. Zuzana Kunická, Ph.D.

Doctoral thesis

Utiliyation of telomerase as diagnostic and predictive tumor marker

Abstract:

Telomeráza je specializovaná reverzní transkriptáza, která umožňuje kompenzovat problém neúplné replikace 3´ konců lineárních eukaryotických chromozomů, telomer. Skládá se ze dvou základních podjednotek – katalytické proteinové podjednotky, která disponuje aktivitou reverzní transkriptázy, a RNA podjednotky, která slouží jako templát pro syntézu nových telomerových repetic. Ve většině zdravých tkání není telomeráza přítomná, výjimku tvoří zárodečné buňky a některé rychle se dělící tkáně. V kontrastu k těmto poznatkům byla aktivace telomerázy pozorována u téměř 100% nádorových buněčných linií a u přibližně 70 - 90 % nádorů. Individuální rozdíly v procentech detekovaných nádorů jsou dány především různorodostí nádorových onemocnění a nádorových tkání, v druhé řadě také díky citlivosti použitých metod stanovení aktivity telomerázy. Detekce telomerázy je nejčastěji prováděna metodou TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol), která využívá k amplifikaci produktů telomerázy PCR, čímž je mnohonásobně zvýšena citlivost stanovení. Variací na TRAP existuje velká řada, a jejich neustálý vývoj a zdokonalování má za cíl získat co nejpřesnější obraz chování telomerázy ve zdravých nebo nádorových buňkách. Tato práce se zabývá zhodnocením možnosti využití stanovení aktivity telomerázy v rutinní diagnostice nádorů, popř. jako prognostického faktoru u některých typů nádorových onemocnění. U mnohočetného myelomu, který patří do skupiny hematoonkologických onemocnění, jsme zjistili, že použití stanovení aktivity telomerázy jako běžného klinického parametru není vhodné, protože separace specifických buněk je velmi nákladná. Kromě toho nebyla aktivita telomerázy zcela specifická pro frakci buněk mnohočetného myelomu. U solidních tumorů, mezi které patří kolorektální karcinom a nádory hlavy a krku, jsme prokázali, že telomeráza může být využita jako diagnostický a prognostický faktor, který může dokonce nahradit některé klasické histopatologické parametry, jako je např. stupeň diferenciace nádoru (grade). Tento poznatek koreluje s výsledky experimentální studie, ve které jsme se zabývali sledováním aktivity telomerázy během působení diferenciačního činidla butyrátu sodného (NaBt) na buněčné linie odvozené ze střevního karcinomu a z embryonální střevní sliznice. Potvrdilo se, že aktivita telomerázy u diferencovaných buněk obou linií klesá až na nulovou hodnotu, avšak u nádorové linie je pokles pomalejší. Dalším závěrem bylo, že vhodnějším ukazatelem stavu aktivace telomerázy v buňkách je stanovení její aktivity spíše než analýza exprese její katalytické podjednotky hTERT na úrovni mRNA. Primární transkript genu kódujícího podjednotku hTERT totiž podléhá alternativnímu sestřihu, jehož deleční produkty buď k aktivitě telomerázy nepřispívají, nebo aktivitu dokonce inhibují. Během diferenciace se sestřihový profil mění ve prospěch delečních variant, a tato změna je rychlejší v případě normálních buněk, což u nich přispívá k rychlejší ztrátě aktivity telomerázy v porovnání s linií nádorovou. V průběhu výzkumu jsme několikrát narazili na nedokonalost běžně používané semikvantitativní metody stanovení telomerázy (TRAP), což vedlo k vývoji a optimalizaci nové modifikace této metody. Dvoubarevná TRAP v reálném čase umožňuje kvantifikaci produktů telomerázy v reálných vzorcích odečítáním hodnot z kalibrační křivky vytvořené z různých koncentrací standardu, který je analogem produktů telomerázy. Přínos zavedení této techniky se plně projevil zejména v recentní studii nádorů hlavy a krku, v níž se díky přesnějšímu kvantitativnímu stanovení podařilo prokázat statistic

Abstract:

ky významnou korelaci vyšší aktivity telomerázy s nižším stupněm diferenciace nádoru, a dále obecně horší prognózu nádorů negativních na aktivitu telomerázy.

Abstract:

Telomerase is a specialised reverse transcriptase, which is partially compensating end-replication problem of linear eukaryotic chromosomes. It is formed from two core subunits – the catalytic protein subunit, disposing of reverse-transcription activity, and RNA subunit, which is a template for synthesis of new telomere repeats. In most healthy tissues is not detectable excluding some exceptions as germline cells and some highly proliferative tissues. In contrast, activation of telomerase was observed in 100% of tumor cell lines and in 70 – 90 % of tumor tissues. Individual variations in percentage of detected positive tumors are in case of heterogeneity of tumor types and tumor tissues. The second possibility is a difference in sensitivity of methods of telomerase activity detection. Telomerase activity is most usually detected by Telomeric Repeat Amplification Protocol (TRAP), which is more sensitive than standard measurement of telomerase activity, because of amplification of telomerase products by PCR. There are lots of TRAP variants designed for one target – to obtain highly reproducible data for a study of telomerase behavior in healthy and tumor cells. This work is focused on evaluation of possible use of measurement of telomerase activity in routine tumor diagnostics or as a prognostic factor in some kinds of tumors. In multiple myeloma, which belongs to the group of hematooncological diseases, we found the telomerase activity not to be particularly useful as a routinely measured parameter because the magnetic separation of specific cells is very expensive and, moreover, telomerase activity is not specific for selected myeloma cells. Telomerase activity, however, was found useful as a perspective diagnostic and prognostic marker in solid tumors as colorectal carcinoma and head and neck tumors and in this type of tumors is telomerase activity more relevant clinical factor than standard grading. This correlates with results of our experimental study of changes of telomerase activity in response to differentiation induced by sodium butyrate (NaBt) in cell lines derived from healthy and tumor colon cells. In both cell lines, telomerase activity in differentiated cells decreased to zero, but the decrease was slower in tumour cells. We also found that telomerase activity is more objective marker of telomerase activation or repression than expression of its catalytic subunit hTERT at the level of mRNA. This is because the primary transcript of hTERT-coding gene is alternatively spliced into deletion products which either do not contribute to the activity, or even inhibit the activity. During differentiation the splicing pattern was shifted towards deletion variants and the change was faster in normal cells which contributed to their faster loss of telomerase activity compared to tumour cells. During our research we found limiting possibilities of semiquantitative TRAP method. Therefore, in our laboratory a modification of TRAP, dual-color real-time TRAP, was developed and optimized that enables quantification of telomerase products with use of calibration curve. This curve is obtained from different concentrations of standard template that is analogue of telomerase products. The impact of the introduced technique was fully exploited namely in the above mentioned recent study in head and neck cancer. Here, thanks to a more precise quantitative evaluation of telomerase activity, a statistically significant correlation between telomerase activity and tumor differentiation grade was found. Further, a generally worse prognosis was observed in telomerase-negative tumors.

Keywords

telomery, telomeres, telomeráza, telomerase, nádor, tumor, real-time, TRAP, marker, diagnostický, diagnostic, prognostický, prognostic, head, neck, multiple, myeloma, colorectal, carcinoma, kolorektální, karcinom, mnohočetný, myelom, stanovení, aktivity, detection, activity, reálný, čas

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 9. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 24. 10. 2008
• Supervisor: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
• Reader: prof. MUDr. Jaroslav Michálek, Ph.D., prof. MUDr. Jiří Ehrmann, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology