Vliv ředidla ejakulátu býků na životaschopnost kryokonzervovaných inseminačních dávek hodnocenou průtokovou cytometrií

Simona Doležalová

Master's thesis

Effect of bulls' semen extender on viability of crypreserved insemination doses assessed by flow cytometry

Abstract:

Diplomová práce je zaměřena na hodnocení vlivu ředidel na životaschopnost kryokonzervovaných inseminačních dávek, která byla posuzována pomocí průtokové cytometrie. V teoretické části jsou shrnuty základní informace o reprodukci skotu, fyziologické a morfologické vlastnosti ejakulátu býků a základní aspekty jeho hodnocení, dále také metody jeho zpracování, brané především z hlediska přídavku LDL do ředidel užívaných při kryokonzervaci. V praktické části je zjišťován vliv přídavku LDL (v koncentraci 0 %, 4 %, 6 % a 8 %) do ředidla na bázi sojového lecitinu Andromed®. Hypotézou této práce je předpoklad, že lze detekovat a kvantifikovat průkazné rozdíly v kvalitě parametrů spermií, úzce spojených s jejich životaschopností (tj. integrita buněčných membrán, funkčnost akrozomu, aktivita mitochondrií), v inseminačních dávkách po rozmrazení ve vztahu k typu aplikovaného ředidla. Na vybrané inseminační stanici byl odebírán ejakulát od předem vybrané skupiny plemenných býků (n = 5), a to s důrazem na jejich stejný věk, plemeno a podmínky výživy, ustájení a ošetřování. Odebraný ejakulát, splňující vstupní podmínky, byl podle daného schématu rozdělen na několik částí tak, aby vznikly různé kombinace přídavku LDL, délky ekvilibrace (120 nebo 240 minut) a typu mrazící křivky (standardní 3-fázová nebo modifikovaná 2-fázová mrazící křivka). Takto vyrobené inseminační dávky byly zmrazeny pomocí automatického mrazícího boxu a uloženy v kontejnerech s tekutým dusíkem (- 196 °C). Po rozmrazení (vodní lázeň 38 °C, po dobu 30 sekund) byly hodnoceny parametry životaschopnosti pomocí průtokového cytometru. Statisticky průkazné výsledky dokumentují nejvyšší průměrné procento spermií s funkčními mitochondriemi při použití ředidla s 8 % přídavkem LDL (78,67 %), poté při 6 % přídavku (74,59 %) a 4 % přídavku (64,44 %). Nejnižší průměrné procento spermií s funkčními mitochondriemi bylo nalezeno při použití ředidla bez přídavku LDL (48,35 %).Při hodnocení intaktnosti membrány a akrozomu ve vztahu k přídavku LDL dosáhl nejvyššího průměrného procenta spermií 6% přídavek LDL (34,17 %), poté 8 % přídavek (34,06 %) a následně 4 % přídavek (33,07 %). Nejnižší průměrné procento spermií s intaktní membránou a akrozomem bylo opět zaznamenáno u ředidla bez přídavku LDL (32,21 %). Tyto rozdíly však nebyly statisticky významné. Při hodnocení parametrů životaschopnosti spermií byly navíc nalezeny statisticky významné rozdíly mezi býky (P < 0,01), je tudíž patrná jejich vzájemná individualita v odpovědi na metodiku zpracování ejakulátu. Taktéž byly nalezeny statisticky významné rozdíly v aktivitě mitochondrií a intaktnosti membrány a akrozomu ve vztahu k délce ekvilibrace (P < 0,01) a v aktivitě mitochondrií ve vztahu k použité mrazící křivce (P < 0,05).

Abstract:

Thesis is focused on the evaluation of the bulls‘ semen extender’s effect on viability of cryopreserved insemination doses as assessed by flow cytometry. The theoretical part summarizes basic information about reproduction in cattle, physiological and morphological properties of bull semen and basic aspects of its evaluation and methods as well as methods of its processing, especially addition of low density lipoproteins (LDL) into extenders used for cryopreservation. The practical part presented the effect of LDL addition (at a concentration of 0 %, 4 %, 6 % and 8 %) into extender based on soy lecithin Andromed®. Hypothesis of this work is the assumption that it is possible to detect the significant differences in the post-thaw quality parameters of spermatozoa, closely related to its viability (i.e. integrity of cell membrane, acrosome intactness, mitochondrial activity), in insemination doses in relation to applied extenders. Semen was being collected at the insemination station from a pre-selected group of breeding bulls (n = 5) with emphasis on their age, breed and nutritional conditions, housing and treatment. After initial evaluation, the collected semen was divided into several parts, according to the given scheme so as to produce different combinations of LDL addition, equilibration length (120 or 240 minutes) and type of freezing curve (standard 3-phase or modificated 2-phase freezing curve). Insemination doses produced in this way were frozen using an automatic freezer and stored in containers with liquid nitrogen (- 196 °C). After thawing (38 °C water bath, for 30 seconds), parameters of viability were evaluated using a flow cytometer. Statistically significant results documented the highest average percentage of spermatozoa with active mitochondria (calculated out of population of sperm cell with membrane and acrosome intactness) using extender with 8 % addition of LDL (78.67 %), then with 6 % addition (74.59 %), and 4 % addition (64.44 %). The lowest average percentage of spermatozoa with active mitochondria was observed in the diluent without LDL addition (48.35 %). When evaluating membrane and acrosome intactness related to LDL addition, the highest average percentage of spermatozoa with intact membrane and acrosome was observed in the diluent with 6 % addition of LDL (34,17 %), then 8 % addition (34.06 %) and 4 % addition (33.07 %). The lowest average percentage of spermatozoa with intact membrane and acrosome was again recorded with the extender without addition of LDL (32.21 %). However, these differences were not statistically significant.Furthermore, when evaluating the parameters of spermatozoa viability, statistically significant differences were found between bulls (P < 0.01), so their mutual individuality in the response to the semen processing is evident. There were also statistically significant differences in mitochondrial activity and membrane and acrosome intactness in relation to the length of equilibration (P < 0.01) and in mitochondrial activity in relation to the freezing curve used (P < 0.05).

Keywords

býk, ejakulát, ředidlo ejakulátu, LDL, průtoková cytometrie, životaschopnost

Keywords

bull, sperm, semen extender, LDL, flow cytometry, viability

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Luděk Stádník, Ph.D.
• Reader: Zuzana Biniová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Animal Science / Animal Science