Strategie nad rámec antibiotik: Pokročilé přístupy pro monitorování lyze bakterií a řešení antimikrobiální rezistence

Mgr. Radka Obořilová, Ph.D.

Disertační práce

Strategies Beyond Antibiotics: Advanced Approaches for Monitoring Bacterial Lysis and Tackling Antimicrobial Resistance

Anotace:

Antimikrobiální rezistence představuje v přírodě běžný obranný mechanismus a důsledek evoluční adaptace bakteriálních populací. Z pohledu zdraví člověka, medicíny, ale i ekonomiky se stává vážným problémem. Nekontrolované užívání antibiotik, často bez povědomí o vzniku a mechanismech rezistence, přináší značná rizika, a boj s bakteriálními infekcemi proto vyžaduje komplexnější přístup. Zdůrazňuje se nutnost přísnějších léčebných protokolů a důslednějšího dodržování terapeutických i preventivních opatření. Tato práce shrnuje základní poznatky o bakteriích jako patogenech nebezpečných pro člověka, které navzdory své primitivní organizaci disponují širokým spektrem obranných mechanismů a často nešetří ani svého hostitele. Jsou zde popsána možná řešení jak z pohledu včasné detekce bakteriálních buněk, tak potenciální alternativní činidla určená k eradikaci bakteriálních kultur. V poslední řadě jsou srovnány běžně používané metody studia vývoje a lyze bakteriální populace s pokročilejšími přístupy biosenzorů a nanotechnologií. Amperometrie byla využita jako rychlá a jednoduchá metoda pro detekci bakterie Melissococcus plutonius, patogena larev včel. Dále bylo vyvinuto kompaktní a cenově dostupné průtokové zařízení pro nepřetržité monitorování kvality pitné vody, které umožňuje detekci bakteriální kontaminace v reálném čase prostřednictvím kultivace a měření zákalu. Systém dosahuje detekčního limitu jedné bakteriální buňky ve 100 mL a zvýšením provozní teploty na 44 °C selektivně zvýhodňuje růst Escherichia coli, čímž zvyšuje specificitu detekce fekální kontaminace. Včasné detekci E. coli v potravinách, tedy v komplikovaném analytickém prostředí, byla umožněna metodou křemenných mikrovážek (QCM) v kombinaci s antifoulingovou úpravou povrchu. Pro vizualizaci průběhu fágem zprostředkované lyze bakterie Staphylococcus aureus v reálném čase a přirozených podmínkách růstového média a teploty 37 °C byla použita atomová silová mikroskopie (AFM). Pro studium chování bakterií přímo na povrchu, kde bakterie přechází do uskupení klastrů a následně tvoří biofilmové formace s jiným fenotypem, klasické přístupy poskytují jen omezené výsledky. Pozorování bakteriální kultury rostoucí přímo na povrchu senzoru a monitorování jejího chování je zaznamenáno jako změna měřeného signálu disipace pomocí QCM. Účinek synergie fág-antibiotikum (PAS) na kulturu S. aureus RN4220 je prokázán za ~ 50 minut po přidání fága P68, ke kterému je bakterie za jiných okolností rezistentní. PAS se tak jeví jako slibná strategie pro terapii multirezistentních bakteriálních kmenů. Zejména v souvislosti s odhalováním mechanismů rezistence vůči lytickým fágům, v našem případě fágům rodu Kayvirus. Byla potvrzena rezistence zprostředkovaná membránově kotveným proteinem PdpSau, který je kódovaný profágem přítomným v genomu S. aureus.

Abstract:

Antimicrobial resistance is a natural defense mechanism and a result of evolutionary adaptation in bacterial populations. However, from the perspective of human health, medicine, and even economics, it has become a serious global concern. The uncontrolled use of antibiotics—often without an understanding of how resistance develops—poses significant risks. As a result, combating bacterial infections requires a more comprehensive approach. There is a growing emphasis on stricter therapeutic protocols and greater adherence to both treatment and preventive measures. This thesis explores bacteria as a major human pathogen that, despite its simplicity, threatens hosts through various defensive strategies. It discusses potential solutions, including early detection of bacterial cells and alternative agents for eradicating bacterial cultures. In addition, it compares conventional methods for studying the evolution and lysis of bacteria with advanced techniques involving biosensors and nanotechnology. Amperometry was used as a rapid and straightforward method to detect Melissococcus plutonius, a pathogen of honeybee larvae. Furthermore, a compact and cost-effective flow-through device was developed for continuous monitoring of drinking water quality, enabling real-time detection of bacterial contamination through cultivation and turbidity measurement. The system achieves a detection limit of a single bacterial cell per 100 mL, and by increasing the operating temperature to 44 °C, it selectively promotes the growth of Escherichia coli, thereby enhancing the specificity for detecting fecal contamination. Early detection of E. coli in food, as a challenging analytical environment, was achieved using a quartz crystal microbalance (QCM) combined with an antifouling surface treatment. Atomic force microscopy (AFM) was used to visualize the course of phage-mediated lysis of Staphylococcus aureus in real-time and under natural growth medium conditions and a temperature of 37 °C. To study the behavior of bacteria directly on the surface, where the bacteria move into clusters and subsequently create biofilm formations with a different phenotype, classical approaches provide incomplete and misleading results. Observing a bacterial culture of S. aureus growing directly on the surface of the sensor and monitoring its behavior can be recorded as a change in the dissipation signal using the QCM. The effect of phage-antibiotic synergy (PAS) on S. aureus RN4220 culture is demonstrated in ~50 min after addition of phage P68, to which the bacterium is otherwise resistant. The PAS appears to be a promising strategy for treating multidrug-resistant bacterial strains Especially considering recent findings on resistance mechanisms against lytic phages, such as those of the Kayvirus genus. In our case, resistance was mediated by the membrane-anchored protein PdpSau, encoded by a prophage integrated into the S. aureus genome.

Keywords

Biosensors, AFM, Lysis monitoring, Phage therapy, Staphylococcus aureus, Bacterial resistance, Biosenzory, Monitorování lyze, Fágová terapie, Bakteriální rezistence

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 5. 2025

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 20. 6. 2025
• Vedoucí: prof. RNDr. Petr Skládal, CSc.
• Oponent: doc. Mgr. Zdenka Fohlerová, Ph.D., doc. RNDr. Lucie Korecká, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie