Study of Biomolecular Dynamics by NMR Spectroscopy

Mgr. Pavel Kadeřávek, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Dynamika biomolekul je důležitá pro jejich správnou funkci v organismech. Nukleární magnetická rezonance (NMR) je vhodná metoda k výzkumu dynamiky biomolekul, protože jako jediná z dostupných metod umožňuje popis pohybů molekul s atomárním rozlišením. Analýza je ovšem značně komplikována jak složitou fyzikální podstatou pohybů (koexistence více pohybových módů, jejich vzájemná provázanost, atd.), tak i praktickými problémy (časová náročnost experimentů, omezené množství dostatečně přesných a správných dat, atd.). Cílem této dizertační práce byl vývoj metod vhodných k výzkumu pohybů biomolekul a jejich aplikace. Prvním úkolem bylo řešení specifických problémů spojených s určováním struktury biomolekul (oligomerní stav biomolekuly, orientace strukturního motivu) pomocí standardních metod analýzy NMR relaxačních dat. Druhým úkolem bylo navrhnout metodu analýzy relaxačních dat, která by snížila zatížení výsledků systematickou chybou oproti existujícím metodám. Nejdříve byly standardní metody analýzy NMR relaxačních dat aplikovány při studiu proteinu lidského aktivačního antigenu lymfocytů, označovaného jako CD69, a při výzkumu N-koncové domény kapsidového proteinu opičího Mason-Pfizerova viru. V prvním případě studie potvrdila dimerní formu proteinu CD69 v roztoku. V druhém případě analýza navrhla preferovanou orientaci strukturního motivu, jenž nebyl dostatečně přesně určen při výpočtu struktury kapsidového proteinu. Zároveň byly charakterizovány i vnitřní pohyby tohoto proteinu. V druhé části práce jsou shrnuta omezení a systematické chyby metod mapování funkcí spektrální hustoty, dále jsou navženy modifikace této metody a ty jsou srovnány s původním přístupem. Vyvinuté metody byly aplikovány při studiu pohybů delta podjednotky RNA polymerasy z bakterie Bacillus subtilis, krátké RNA molekuly obsahující UUCG smyčku a konečně molekuly disacharidu. Jednotlivé příklady se neliší pouze typem biomolekuly o níž se jedná (protein, nukleová kyselina, sacharid), ale také použitým izotopovým značním molekuly (neselektivní značení pomocí dusíku N-15, neselektivní dvojité značení pomocí dusíku N-15 a uhlíku C-13 a nakonec selektivní značení izotopem C-13). Tato různorodost poukazuje na široké pole aplikovatelnosti vyvinuté metody.

Abstract:

The dynamics of the biomolecules is important for their correct functions in living organisms. Nuclear magnetic resonance (NMR) is eligible method of the investigation of the motions of biomolecules as it is the only method which can provide dynamical information with atomic resolution. However, both a complex physical nature of motions (several motional modes in action, coupling between them, etc.) and practical obstacles (experimental time demands, limited set of sufficiently precise and accurate data available, etc.) complicate the analysis. The present thesis focuses on the methodology of investigation of biomolecular dynamics and its applications. The first goal was to solve specific problems related to biomolecular structure (oligomeric state, orientation of a structural motif) by employing currently available methods of analysis of NMR relaxation. The second task was to increase the accuracy of the existing methods for investigation of biomolecular dynamics by the analysis of NMR relaxation data. First, the standard methods were applied to investigate motions of human activation antigen of lymphocytes CD69 and of the N-terminal domain of capsid protein from Mason-Pfizer monkey virus. The comparison of the experimental data with simulations of diffusive rotation of CD69 protein confirms its dimeric form in solution. A preferential orientation of a structural motif was suggested by a similar study applied to the N-terminal domain where the structural data do not characterize the structure unambiguously. In addition, insight into the dynamics of the protein was provided. The second part summarizes first the limitations of the standard methods of the reduced spectral density mapping. Then, alternative approaches are proposed and compared with the original technique. The developed methods were applied to the studies of the delta subunit of ribonucleic acid (RNA) polymerase from Bacillus subtilis, a short 14-nt RNA molecule including a UUCG loop, and a disaccharide molecule. Each of the last three molecules represents a specific case, where limitations as well as advantages of individual methods are demonstrated. The selected molecules differ not only in composition (protein, nucleic acid, carbohydrate) but also in the labeling schemes (uniform N-15 labeling, uniform C-13, N-15 labeling and site specific selective labeling by C-13 isotope) and size. Such a variety documents a broad applicability of the developed methodology.

Keywords

NMR, pohyby biomolekul, dynamika, relaxace, mapování funkcí spektrální hustoty NMR, motions of biomolecules, dynamics, relaxation, spectral density mapping

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 2. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 27. 2. 2013
• Supervisor: doc. RNDr. Radovan Fiala, CSc.
• Reader: Fabien Ferrage, Ph.D., doc. RNDr. Jan Lang, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biomolecular Chemistry