Mikroskopická analýza tubulinového cytoskeletu v adventivních kořenech vojtěšky seté (Medicago sativa L.) a příprava nových markerů tubulinu s eGFP pod různými promotory

Bc. Barbora HÁJKOVÁ

Master's thesis

Microscopic analysis of tubulin cytoskeleton in Alfalfa (Medicago sativa L.) adventitious roots and preparation of new tubulin markers with eGFP under different promoters

Abstract:

Medicago sativa je významná zemědělská plodina, která dokáže symbioticky interagovat s půdními bakteriemi Rhizobium. Tyto interakce jsou velmi důležité především díky potenciálu M. sativa obohacovat půdu o dusík, který ze symbiózy získává. Celého procesu symbiotické interakce se účastní rostlinný cytoskelet, který podléhá neustálé reorganizaci během jednotlivých fází interakce. Pro studium dynamiky cytoskeletu jsou využívány geneticky-kodované fluorescenční markery, které umožňují jeho vizualizaci in vivo. Tyto markery je možné připravit metodami molekulární biologie a transformovat do rostlin, ve kterých je po regeneraci možné cytoskelet vizualizovat. M. sativa bývá často regenerována a propagována somatickou embryogenezí, která je velmi časově náročná. Z tohoto důvodu byla pro vegetativní propagaci M. sativa v diplomové práci optimalizovaná a ověřená poměrně rychlá a snadná metoda rozmnožování rostlin indukcí tvorby adventivních kořenů na stonkových odřezcích. V adventivních kořenech rostlin exprimujících molekulární fluorescenční marker pro mikrotubuly byla provedena mikroskopická analýza organizace mikrotubulů. Také byla potvrzena symbiotická interakce adventivních kořenů s bakteriemi Sinorhizobium meliloti. Dalším cílem práce byla příprava nových tubulinových markerů s genem eGFP pod kontrolou třech konstitutivních promotorů p35S, pEF1 a pUBQ10 pro optimalizaci exprese markerů v transformovaných rostlinných buňkách a zvýšení jejich exprese v symbiotických hlízkách. Nové markery byly ověřeny pomocí tranzientní transformace listů Nicotiana benthamiana. Následnou statistickou analýzou byla zjištěna mnohem vyšší intenzita fluorescence nových markerů oproti dříve připraveným markerům s genem GFP.

Abstract:

Medicago sativa is an important agricultural crop that can symbiotically interact with soil bacteria called rhizobia. This interaction is very useful mainly due to the potential of M. sativa to enrich soil with nitrogen obtained from the symbiosis. The entire process of symbiotic interaction involves plant cytoskeleton, which undergoes constant reorganization during different phases of the interaction. To study cytoskeletal dynamics, genetically encoded fluorescent markers enabling its visualization in vivo are frequently used. Such markers can be prepared using molecular biology methods and subsequently transformed into plants, where the cytoskeleton can be visualized. M. sativa is often regenerated and propagated via somatic embryogenesis, which is very time-consuming and laborious. For this reason, a relatively quick and easy method for vegetative propagation of M. sativa plants by inducing the formation of adventitious roots on stem cuttings was optimalized and tested in the thesis. Next, microscopic analysis of microtubule organization and dynamics was performed in adventitious roots of plants expressing molecular fluorescent marker for microtubules. Additionally, a symbiotic interaction of adventitious roots with Sinorhizobium meliloti was observed. Another aim of the thesis was to prepare new tubulin markers containing eGFP gene under the control of three constitutive promoters p35S, pEF1 and pUBQ10 to optimalize expression of these markers in transformed alfalfa cells and tissues and also to enhance expression in symbiotic nodules. New markers were verified using transient expression in Nicotiana benthamiana leaves. Subsequent statistical analysis revealed a much higher fluorescence intensity of the new markers compared to previously-prepared markers with the GFP gene

Keywords

Adventivní kořeny, fluorescenční markery, cytoskelet, Medicago sativa, mikrotubuly, symbióza, Sinorhizobium meliloti

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 4. 2024

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biotechnology and Genetic Engineering / Biotechnology and Genetic Engineering