Charakterizace modifikací histonů v modelových organismech

Mgr. Sylva Brabencová, Ph.D.

Doctoral thesis

Characterization of histone modifications in model organisms

Anotácia:

Epigenetické modifikace histonů, jako jsou methylace, acetylace, fosforylace aj. hrají klíčovou roli v regulaci genové exprese. Acetylace histonů jsou spojeny s aktivací transkripce; snížením pozitivního náboje lyzinových nebo argininových zbytků dojde k oslabení interakce mezi DNA a histony, důsledkem čehož je rozvolněná struktura chromatinu přístupná pro vazbu transkripčních faktorů. Hladina acetylace histonů je dynamická, mění se v závislosti na stavu buňky a v reakci na podmínky prostředí. Připojení acetylové skupiny katalyzují enzymy histon acetyltransferázy a její odstranění histon deacetylázy. V praktické části dizertační práce byly analyzovány hladiny acetylace histonů v modelových rostlinách Arabidopsis thaliana ecotypů Columbia a Wasilewskija metodou hmotnostní spektrometrie, včetně optimalizace přípravy vzorků. Porovnáním hladiny acetylace histonů izolovaných z listů rostlin vypěstovaných ze semen jedné rostliny a ze směsi semen získaných z více rostlin byla určena míra inter-individuální variability acetylace histonů a v souvislosti s tím i počet rostlin nutných pro relevantní analýzu. Dále byl sledován fenotyp a analyzovány hladiny acetylace histonů v listech rostlin A. thaliana ekotypu Columbia s mutací v genu pro histon deacetylázu HDA6, a listech rostlin klíčících v přítomnosti inhibitorů histon deacetyláz. Fenotyp klíčních rostlin vystavených účinku inhibitorů histon deacetyláz byl výrazně ovlivněn, i když hladina acetylací histonů byla změněna méně než v mutantních rostlinách, které byly fenotypově srovnatelné s rostlinami standardního typu. Po přesazení do půdy došlo k reverzi fenotypu rostlin klíčících v přítomnosti inhibitorů a srovnatelná s kontrolními vzorky byla i hladina acetylace histonů v listech. Na základě těchto výsledků je možno usuzovat na komplexní účinek studovaných epigeneticky aktivních látek, které kromě aktivity histon deacetyláz pravděpodobně ovlivňují i další procesy. Analýza délky telomer v rostlinách s nefunkčními enzymy katalyzujícími acetylaci histonů a rostlinách standardního typu vystavených inhibitorům histon deacetyláz během klíčení neukázala žádnou změnu oproti kontrolním rostlinám, stabilita telomer v rostlině A. thaliana tedy není ovlivněna těmito zásahy do hladiny acetylace histonů. Výsledky získané v rámci této disertační práce přispěly ke zjednodušení analýzy modifikací histonů metodou hmotnostní spektrometrie ve vzorcích izolovaných z rostlinných pletiv a ukázaly – společně s dalšími daty získanými v naší laboratoři, že stabilita rostlinných telomer není výrazně ovlivněna změnou celkového epigenetického stavu, jak bylo prezentováno pro buňky živočišné.

Abstract:

Epigenetic modifications of histones, e.g., methylation, acetylation or phosphorylation, play a key role in the regulation of gene expression. Acetylation of histones is associated with transcriptional activation; decrease of positive charge of lysine and arginine residues results in a weaker interaction between DNA and histones and relaxed chromatin structure accessible for binding of transcription factors. Acetylation is a dynamic modification, its level varies depending on the cell development and environmental conditions. The transfer of acetyl group is catalyzed by histone acetyltransferases, and its removal by histone deacetylases. In experimental part of the thesis, the levels of histone acetylation in Arabidopsis thaliana plants, ecotypes Columbia and Wasilewskija, were analyzed by mass spectrometry, including optimization of samples preparation. By comparing the levels of acetylation of histones isolated from leaves of plants grown from seeds collected from one plant or from a mixture of seeds collected from several plants, the level of inter-individual variability of histone acetylation was determined and, accordingly, the number of plants required for relevant analysis. Next, the phenotype and histone acetylation of A. thaliana plants of the Columbia ecotype with loss of function of the gene encoding histone deacetylase HDA6, and plants germinating in the presence of histone deacetylase inhibitors were studied. The phenotype of seedlings exposed to the histone deacetylase inhibitors was significantly affected, although the levels of histone acetylation were changed to lower extent compared to the mutant plants that were phenotypically comparable to wild type plants. After transfer to the soil, the phenotype of plants germinated in the presence of inhibitors was recovered and the levels of histone acetylation in leaves were comparable to control samples. These results demonstrated complexity of the action of studied epigenetically active drugs, which probably influence also other processes besides the activity of histone deacetylases. Lengths of telomeres were maintained in plants with the T-DNA insertion in genes encoding histone acetyltransferases and wild type plants exposed to histone deacetylase inhibitors during germination. Thus, telomere stability in A. thaliana was not affected by these modulations of histone acetylation level. Data presented in this thesis contributed to the optimization of the analysis of histone modifications in plant samples by mass spectrometry and showed – together with other data obtained in our laboratory - that the stability of plant telomeres is not significantly influenced by the modulation of the general epigenetic state, in contrast to observations in animal cells.

Kľúčové slová

Arabidopsis thaliana, acetylace, histony, telomery, chromatin, hmotnostní spektrometrie, acetylation, histones, telomeres, mass spectrometry

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 12. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 31. 1. 2020
• Vedúci: doc. Mgr. Miloslava Fojtová, CSc.
• Oponent: RNDr. Karel J. Angelis, CSc., doc. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics