Charakterizace substrátové specifity cytokinindehydrogenas v různých pletivech kukuřice a charakterizace enzymu ZmCKX6

Eva DOHNÁLKOVÁ

Master's thesis

Characterization of cytokinin dehydrogenase substrate specificity in maize tissues and characterization of enzyme ZmCKX6

Abstract:

Cytokininy jsou důležitými rostlinnými regulátory růstu a vývoje rostlin a jejich hladina je kontrolována mimo jiné enzymy zvanými cytokinindehydrogenasy (CKX). Rostliny obsahují CKX rodiny o různém počtu členů. Genom kukuřice (Zea mays L.) obsahuje 13 ZmCKX genů. Jediná isoforma ZmCKX6 není aktivní v in vitro testech. Cílem diplomové práce bylo stanovení specifické aktivity cytokinindehydrogenas v pletivech kukuřice v různých stádiích vývoje. Byly provedeny 2 druhy extrakcí, nejprve bez detergentu a následně s detergentem Triton X-100. Prvotním cílem bylo zjistit, jestli je možné vyextrahovat různé isoformy ZmCKX (apoplastické a intracelulární), které bychom byli schopni odlišit porovnáním s jejich expresními profily a na základě jejich substrátové preference. Funkčnost tohoto zvoleného přístupu byla nejlépe pozorována u čnělek s bliznami, kdy se pravděpodobně podařilo vyextrahovat bez detergentu především apoplastickou isoformu ZmCKX1 a také ZmCKX12. Při použití detergentu došlo k vyextrahování mimo těchto isoforem navíc zřejmě také vakuolární ZmCKX5. Druhým cílem této práce bylo provedení heterologní exprese, purifikace a následné biochemické charakterizace tří variant enzymu ZmCKX6. Podařilo se připravit všechny tři varianty: nativní variantu ZmCKX6 (WT, wild type) a dvou jeho mutovaných variant, nesoucí bodovou mutaci v konzervovaných motivech HFG a PHPWLN. Tyto rekombinantní proteiny byly exprimovány v expresním systému Escherichia coli, purifikovány pomocí afinitní chromatografie. Byla potvrzena nefunkčnost proteinu ZmCKX6-WT. U aktivních forem ZmCKX6-HFG a ZmCKX6-PHPWLN byla dále studována substrátová specifita s využitím metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie (UHPLC). Bylo zjištěno, že varianta ZmCKX6-HFG je až 150 krát aktivnější než ZmCKX6-PHPWLN. Prefererovaným substrátem pro tento enzym byl N6-(2-isopentenyl)adeninribosid (iPR) a také volné cytokininové base. Tyto výsledky prokazují, že pro aktivitu CKX enzymů je zcela zásadní HFG motiv, který je silně konzervovaný u všech zbývajících kukuřičných isoforem.

Abstract:

Cytokinins are important regulators of growth and development in plants and their level is controlled among others by enzymes called cytokinin dehydrogenases (CKX). Plants contain small CKX families with various numbers of members. The genome of maize (Zea mays L.) encompases 13 ZmCKX genes. The only isoform ZmCKX6 is not active in in vitro assays. The aim of this thesis was to determine the specific activity of cytokinin dehydrogenases in maize tissues at different developmental stages. Two extraction methods were performed, first without detergent and then with the detergent Triton X-100. The primary objective was to determine whether it is possible to extract different ZmCKX isoforms (apoplastic and intracellular), which we could distinguish based on their qPCR expression profiles and their substrate preferences. The functionality of this approach was demonstrated best in silks. Apoplastic isoform ZmCKX1 and also ZmCKX12 were extracted without detergent while using detergent vacuolar isoform ZmCKX5 was isolated, most likely. The second objective of this work was to perform heterologous expression, purrification and then biochemical characterization of three variants of ZmCKX6 enzyme. All three variants were successfully prepared: native variant of ZmCKX6 (WT, wild type) and two mutant variants in conserved motives HFG and PHPWLN, respectively. The recombinant proteins were expressed in a heterologous expression system Escherichia coli, purified by affinity chromatography. The nonfunctionality of native ZmCKX6-WT was confirmed. The substrate specificity of functional ZmCKX6 variants was studied using high performance liquid chromatography (UHPLC) method. The ZmCKX6-HFG variant was up to 150 fold more active than ZmCKX6-PHPWLN. Preferred substrate for this enzyme was N6-(2-isopentenyl)adenine 9-riboside (IPR) and cytokinin free bases. These results show that HFG motif is essential for CKX activity, it is highly conserved in all the other maize isoforms.

Keywords

Zea mays L., rekombinantní protein, cytokinin, cytokinindehydrogenasa, substrátová specifita, konzervovaný motiv

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 8. 2014

Accessible from:: 22. 8. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 28. 8. 2014
• Supervisor: Mgr. David Zalabák

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry