Biosenzory založené na acetylcholinesterase pro stanovení pesticidů

Mgr. Zuzana Křenková

Diplomová práce

Acetylcholinesterase based biosensors for pesticides detection

Anotace:

Diplomová práce byla zaměřena na přípravu funkčního elektrochemického biosenzoru na bázi acetylcholinesterasy (AChE), pomocí kterého by bylo možné stanovit organofosforové (OP), popřípadě karbamátové (CB), pesticidy. Navržený biosenzor reaguje na přítomnost organofosforofých nebo karbamátových pesticidů ve vzorku úbytkem aktivity biorekogničního elementu: acetylcholinesterasy. To se projeví nepřímoúměrně na množství přeměněného acetylthiocholinu na thiocholin, který se následně stanoví elektrochemicky. Pro konstrukci tohoto biosenzoru jsme použili standardní tříelektrodové amperometrické senzory vyrobené metodou sítotisku. Zvolili jsme vhodný elektrodový systém, způsob imobilizace AChE a optimální metodu detekce. Podařilo se nám optimalizovat některé z reakčních podmínek a vyhodnotit kinetické parametry enzymové reakce. Následně jsme zjistili i vhodné analytické parametry pro kalibrační roztoky modelových vzorků diisopropylfluorofosfátu (DFP) a paraoxon-ethylu. Jako vhodnou inkubační dobu pro tyto dva modelové vzorky jsme zvolili 30 minut. Mez detekce se pro oba řádově pohyboval v hodnotě 10-5 mol/l, pro paraoxon-ethyl byl však zhruba 5x vyšší. V rámci stanovení pesticidů v modelových vzorcích jsme zvážili i ovlivnění měření interferujícími látkami, které se běžně vyskytují v přírodních vzorcích. Jako kontrolní metodu výsledků jsme zvolili spektrofotometrické stanovení Ellmanovou metodou. Z acetylthiocholinchloridu (ATChCl) vzniká během enzymové reakce thiocholin, který dále reaguje s 5,5´-dithiobis-(2-nitrobenzoovou) kyselinou (DTNB) za vzniku žlutě zbarveného thionitrobenzoátu. Spektrofotometricky měříme minutovou změnu absorbance tohoto roztoku při 412 nm ihned po přidání DTNB. V přítomnosti inhibitorů AChE je tato reakce blokována.

Abstract:

Master's thesis was focused on the preparation of functional electrochemical biosensor based on enzyme acetylcholinesterase. The biosensor is suitable for assay of organophosphorus or carbamate pesticides. The advantage of this biosensor is sensitivity, rapid measurement, easy utilization and the portability. The proposed biosensor responds to the presence organophosphorus or carbamate pesticides in the sample by loss of acetylcholinesterase activity. The amount of thiocholine converted from acetylthiocholine chloride during the enzymatic reaction is characterized by indirect proportion. Thiocholine is further proved electrochemically. I used three-electrode standard sensors produced by screen printing for the construction of biosensor. We chose a suitable electrode system, method of immobilization of acetylcholinesterase and the optimal method of detection. After that, we managed to optimize some of the reaction conditions and to evaluate the kinetic parameters of the enzyme reaction. Subsequently, we found the appropriate analytical parameters for model calibration solutions of organophosphate pesticides diisopropylfluorophosphate and paraoxon-ethyl. As a suitable incubation period for these two model samples, we chose 30 minutes. We evaluated the limit of detection for the both organophosphorous pesticides in the order 10-5 mol/l, however, it was 5 times higher for paraoxon-ethyl than for diisopropylfluorophosphate We considered the influence of interferential elements commonly found in the natural samples performed in order to assay pesticides. We chose spectrophotometric determination by Ellman´s method as a control method of achieved results. Acetylcholinesterase forms thiocholine from acetylthiocholine chloride during the enzymatic reaction. That further reacts with 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) - further abbreviated as DTNB to produce a yellow color. I measured the change of the absorbance in one minute spectrophotometrically at 412 nm immediately after adding DTNB. In the presence of acetylcholinesterase inhibitors, this reaction is blocked.

Klíčová slova

Acetylcholinesterasa, biosenzor, organofosforové pesticidy, sítotisk

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 1. 6. 2010
• Vedoucí: RNDr. Lucie Korecká, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů