Konstrukce reportérových buněčných linií pro toxikologické a environmentální aplikace

Mgr. Iveta BARTOŇKOVÁ

Doctoral thesis

Construction of reporter cell lines for toxicological and environmental applications

Abstract:

Endokrinní disruptory (EDCs) jsou látky mající schopnost interagovat se signálními dráhami endokrinního systému, jejíž hlavním mechanismem je změna transkripční aktivity jaderných receptorů. Příkladem těchto látek jsou nejrůznější pesticidy, potravinová aditiva a kontaminanty nebo látky znečišťující životní prostředí. Vzhledem ke vlivu endokrinních disruptorů na živé organismy včetně člověka představuje vývoj spolehlivých detekčních systémů jeden z hlavních směrů jejich studia. V předkládané disertační práci jsem se zabývala konstrukcí a charakterizací lidských stabilně transfekovaných reportérových buněčných linií určených pro stanovení transkripční aktivity androgenního receptoru (buněčná linie AIZ-AR) a vitamin D receptoru (buněčné linie IZ-CYP24 a IZ-VDRE). Tyto buněčné linie představují unikátní lidský reportérový systém odvozený od lidských nádorových buněčných linií exprimujících plně funkční androgenní receptor/vitamin D receptor, které byly transfekovány reportérovými plasmidy obsahujícími reportérové sekvence odvozené z lidských AR/VDR responsivních genů. Všechny výše zmíněné buněčné linie byly plně funkční po více než 2 měsíce v buněčné kultuře, což odpovídá více než 25 pasážím, a stejně tak i pro kryoprezervaci. Spolehlivá detekce AR/VDR ligandů je možná již po osmi hodinách po aplikaci látek. Výše uvedené stabilní buněčné linie jsou natolik citlivé, že umožňují testování v 96-jamkovém formátu. Specifita buněčných linií byla ověřena testováním modelových ligandů ostatních steroidních a jaderných receptorů, přičemž nebyly pozorovány žádné signifikantní indukce luciferázové aktivity, které by potenciálně mohly ovlivnit interpretaci experimentálních dat. Závěrem lze konstatovat, že lidské stabilně transfekované reportérové buněčné linie AIZ-AR, IZ-CYP24 a IZ-VDRE představují rychlý, spolehlivý, efektivní, selektivní a reprodukovatelný nástroj pro detekci ligandů a aktivátorů lidského androgenního receptoru, respektive vitamin D receptoru. Využití těchto linií spočívá ve farmakologických, environmentálních a toxikologických aplikacích.

Abstract:

Endocrine disrupting chemicals (EDCs) are substances possessing the ability to interfere with endocrine signalling by altering steroid hormone homeostasis and the transcriptional activity of nuclear receptors. Examples of EDCs are agrochemicals, food additives and contaminants, and industrial and environmental pollutants. Given the impact of EDCs on human health and living organisms in general, it is relevant and interesting to develop reliable tools for the detection of endocrine disruptors. In the present thesis, I describe the development and characterization of human stably transfected reporter cell lines for the assessment of androgen receptor (AR; AIZ-AR cell line) and vitamin D receptor (VDR; IZ-CYP24 and IZ-VDRE cell lines) transcriptional activities. These cell lines represent unique entirely human systems derived from human cancer cell lines expressing fully functional endogenous AR and/or VDR, respectively, that were transfected with reporter plasmids containing reporter sequences from promoter regions of human AR and/or VDR-responsive genes. These cell lines remained fully functional for over 2 months in the culture (this period corresponds to more than 25 cell passages) as well as after a freezethaw cycle. The reliable detection of ligands of human AR and VDR, respectively, is possible as soon as after 8 hours of the incubation. The assay was sensitive enough to allow for experiments in 96-well plates. The specificity of luciferase induction was proven by applying model ligands of other nuclear and steroid receptors: no significant off-activation was observed. In conclusion, the human stably transfected reporter cell lines AIZ-AR, IZ-CYP24 and IZ-VDRE present rapid, reliable, effective, sensitive, selective and reproducible tools for identification of ligands and activators of human AR and VDR, respectively. These cell lines can potentially be used in pharmacological, environmental and toxicological studies.

Keywords

stabilní transfekce, vitamin D receptor, reportérová esej, endokrinní disrupce

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 6. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 4. 9. 2017
• Supervisor: prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology