Testování teplotní uniformity termocyklérů pomocí analýzy teploty tání stejného amplikonu

Bc. Eva HRUŠKOVÁ

Master's thesis

Testing the temperature uniformity of the thermocyclers using melting temperature of the same amplicon

Anotácia:

Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qPCR) patří k nejčastějším metodám užívaným v biologickém výzkumu. Všechny výzkumné oblasti jako medicína, veterinářství, forenzní výzkum, potravinářství a další jsou dnes na této metodě závislé. Obecně je PCR založena na cyklických změnách teploty, proto jsou na teplotní uniformitu termocykléru, přesnost a správnost výsledků kladeny přísné požadavky. Pro zaručení správné funce a splnění akreditačních požadavků laboratoře (ISO 15189, ISO 17025) je nutno termocykléry pravidelně kalibrovat akreditovanými kalibračními laboratořemi. Ty však často nejsou vybaveny pro kalibraci termocyklérů s uzavřenou konstrukcí jako v případě LightCycler 480 II nebo Rotor-Gene 3000TM, proto je třeba vyhledat jinou metodu. Teoretická část této diplomové práce je zaměřena na zdůvodnění důležitosti kalibrace termocyklérů a přehled dostupných kalibračních metod. V praktické části je porovnávána teplota tání (Tm) stejné amplifikované sekvence DNA v termocyklérech dostupných v Laboratoři experimentální medicíny Ústavu molekulární a translační medicíny, Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci. Dále je hodnoceno, zda uniformita těchto přístrojů odpovídá parametrům deklarovaným výrobcem a parametrům vyžadovaným dle akreditace. Součástí této části je vytváření prototypu přenosné soupravy pro kalibraci termocyklérů typu LightCycler.

Abstract:

The quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) is one of the most common methods used in biological research. All fields of research like medicine, veterinary, forensic research, the food industry and others, depend on this method these days. In general, PCR is based on the temperature changes, co the defined requirements are set on the temperature uniformity of thermocyclers, precision and accuracy of results. To assure the proper function and to fulfill acreditation requirements of laboratory (ISO 15189, ISO 17025), it is necessary to calibrate thermocyclers regularly by accredited calibration laboratories. However, they are sometimes not equipped for the calibration of closed construction thermocyclers like LightCycler 480 II or Rotor-Gene 3000TM, so the different method has to be find. The theoretical part of the diploma thesis is focused on the justifying of the thermocyclers calibration importance and summary of the available calibration methods. Within the practical part, the melting temperature (Tm) of the same amplified sequence in thermocyclers present in the Laboratory of Experimental Medicine, Institute of Molecular and Translational Medicine, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University Olomouc is compared. Furthermore, the parameters declared by the manufacturers and the fulfilment of acreditation requirements for the temperature block uniformity are evaluated. One part of this thesis concerns development of the portable calibration kit for calibration of LightCycler-typed thermocyclers.

Kľúčové slová

variabilita, akreditace, kalibrace, kalibrační souprava, PCR

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 4. 2015

Zverejniť od: 22. 4. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: doc. Mgr. Jiří Drábek, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biology / Molecular and Cell Biology