Příprava rekombinantních enzymů Fe superoxiddismutasy 2/3 z rostliny Arabidopsis thaliana

Gabriela ŠERÁ

Bakalářská práce

Preparation of recombinant Fe superoxide dismutase 2/3 enzymes from Arabidopsis thaliana

Anotace:

Superoxiddismutázy jsou nepostradatelnou složkou enzymatické antioxidační obrany rostlin, jelikož zprostředkovávají přeměnu superoxidu na peroxid vodíku, který je současnou literaturou popisován jakožto významná signální molekula. Díky této specifické reakci neřadíme superoxiddismutázy jenom mezi důležité prvky obrany rostlin, ale taktéž mezi esenciální součást signálních a vývojových procesů rostlin. V chloroplastu, kde probíhá jeden z nejvýznamnějších procesů rostlin známý jako fotosyntéza, se nachází u rostliny Arabidopsis thaliana tři významné Fe superoxiddismutázy (FSD) a to konkrétně FSD1, FSD2 a FSD3. FSD2 a FSD3 mají významnou roli při obraně chloroplastu před oxidativním stresem spojeným s fotosyntézou a jsou esenciální pro raný vývoj chloroplastu. Jsou taktéž součástí plastid-encoded polymerase (PEP) komplexu. Ten zodpovídá za transkripci genů kódovaných v plastidovém genomu, kde se nachází naprostá většina genů potřebných pro plnou funkci fotosyntetického aparátu. Z tohoto důvodu byla teoretická část bakalářské práce věnována shrnutí nejdůležitějších poznatků o reaktivních formách kyslíku, antioxidační obraně rostlin a superoxiddismutázách, se zaměřením na FSD2 a FSD3. Pomocí molekulárních klonovacích technik byly připraveny konstrukty pro přípravu fúzních rekombinantních proteinů pMAL-c2X::FSD2, pGEX6P1::FSD2 a pMAL-c2X::FSD3, pGEX6P-1::FSD3. Tyto konstrukty byly následně využity pro přípravu rekombinantních proteinů v bakteriálním expresním systému. Následnou afinitní purifikací byly získány čisté frakce GST-FSD2, MBP-FSD2 a GST-FSD3, MBP-FSD3 proteinů, na kterých byla provedena biochemická analýza. V experimentální části byla také provedena selekce fsd2 a fsd3 mutantů pomocí alelově specifické PCR a jejich fenotypová analýza. Selektované mutantní linie a připravené rekombinantní enzymy budou sloužit pro následné studium úloh FSD2 a FSD3 u Arabidopsis.

Abstract:

Superoxide dismutases are an indispensable component of the enzymatic antioxidant defence of plants, as they mediate the conversion of superoxide to hydrogen peroxide, which is described in the current literature as an important signalling molecule. This specific reaction makes superoxide dismutases not only an important element of plant defence but also an essential component of plant signalling and development. Three important Arabidopsis thaliana Fe superoxide dismutases (FSDs), namely FSD1, FSD2 and FSD3, are found in the chloroplast, where one of the most important plant processes, known as photosynthesis, takes place. FSD2 and FSD3 play an important role in chloroplast defence against oxidative stress, which is associated with photosynthesis. Moreover, both are essential for early chloroplast development as a part of the plastid-encoded polymerase (PEP) complex, which is responsible for the transcription of genes encoded in the plastid genome. For this reason, the theoretical part of the bachelor thesis was devoted to summarizing the most important knowledge about reactive oxygen species, antioxidant defence of plants and superoxide dismutases with a focus on FSD2 and FSD3. Using molecular cloning techniques, various constructs for the preparation of recombinant fusion proteins were prepared: pMALc2X::FSD2, pGEX6P-1::FSD2, pMAL-c2X::FSD3 and pGEX6P-1::FSD3. These constructs were subsequently used to prepare recombinant proteins in a bacterial expression system. Subsequently, specific affinity purification was performed and purified fractions of GST-FSD2, MBP-FSD2, GST-FSD3 and MBP-FSD3 were analysed by using biochemical approaches. In the experimental part, selection of fsd2 and fsd3 mutants by allele-specific PCR and their phenotypic analysis were also performed. The selected mutant lines and the prepared recombinant enzymes will be used for subsequent studies of FSD2 and FSD3 role in Arabidopsis.

Klíčová slova

(a)biotický stres, reaktivní formy kyslíku, antioxidační ochrana, chloroplast, superoxiddismutázy, FSD2, FSD3, Arabidopsis thaliana

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 3. 5. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Petr Dvořák, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Molekulární a buněčná biologie / Molekulární a buněčná biologie