Studium povrchových proteinů spermií se zona pellucida vazající aktivitou

Bc. Eliška Kaufmanová

Diplomová práce

Study of sperm surface proteins with zona pellucida binding activity

Anotace:

Primární a sekundární vazba spermie na zona pellucida (ZP) oocytu jsou nezbytnými kroky k úspěšnému oplození, a proto je studium a identifikace receptorů, které se interakce gamet účastní, předmětem neustálého zkoumání. Na kančích spermiích bylo doposud popsáno a charakterizováno několik receptorových proteinových molekul s vazebnou aktivitou k ZP. Předkládané diplomová práce vychází ze studie, ve které byl připraven panel monoklonálních protilátek proti povrchovým proteinů kančí spermie se schopností interakce s glykoproteiny prasečí ZP. Zabývali jsme se lokalizací a detekcí proteinů značených monoklonálními protilátkami 1E3 a 2E1 s cílem určit jejich možný původ v souvislosti s jejich případnou funkcí ve spermiích. K detekci proteinů rozpoznávaných protilátkami 1E3 a 2E1 ve spermiích v různých fázích jejich funkčního vývoje, v tkáních a tekutinách reprodukčního traktu bylo využito imunodetekce a nepřímé fluorescenční mikroskopie za účelem jejich lokalizace. Protein značený pomocí 1E3 byl detekován v extraktu z ejakulovaných a kapacitovaných spermií, ze spermií s indukovanou akrosomální reakcí a v extraktu tkání varlete a nadvarlete jako protein o molekulové hmotnosti 45 kDa. Dále byla jeho detekce úspěšná i v epididymální tekutině (57 kDa) a semenné plasmě (59 kDa). Bylo zjištěno, že tento protein je lokalizován v akrosomální oblasti hlavičky. V případě ejakulovaných a kapacitovaných spermií byl navíc zaznamenán silnější signál protilátky v apikální oblasti. Výsledky také ukázaly fluorescenční signál v akrosomální oblasti po akrosomální reakci. Detekce proteinu značeného protilátkou 2E1 byla provedena v extraktu proteinů z ejakulovaných spermií, kde byl přítomen v několika formách (54, 220, >300 a >500 kDa). Lokalizován byl v akrosomové oblasti u ejakulovaných a kapacitovaných spermií. Po akrosomální reakci nebyl protein detekován.

Abstract:

Primary and secondary binding of sperm to oocyte zona pellucida (ZP) are the fundamental steps to succesful fertilization and therefore the studying and identification of receptors, which are involved in the gamete interaction, is the subject of continuous research. Several receptor molecules with ZP-binding activity have been heretofore described and characterised on boar sperm. The submitted diploma thesis is based on a study where a panel of monoclonal antibodies against proteins from the sperm surface with interaction with boar ZP glycoproteins was prepared. We searched out the localization and detection of proteins recognised by monoclonal 1E3 and 2E1 antibodies to determining their origin with their possible function in sperm. Immunodetection was used for the detection of those proteins in sperm in different phases of their functional development, in tissue and fluids of reproductive tract and an indirect immunofluorescent technique was used for their localization. Protein recognised by 1E3 antibody was detected in the protein extract from ejaculated, capacitated sperm, sperm after induced acrosomal reaction and from tissue extract as protein with approximate molecular weight of 45 kDa. Its detection was succesful also in epididymal fluid (57 kDa) and seminal plasma (59 kDa). It was found out that this protein is localised in the acrosome region of the sperm head. In the case of ejaculated and capacited sperm the signal was also present in the apical region. Our results also showed fluorescent signal in the acrosome region after acrosomal reaction. Protein recognised by 2E1 antibody was detected in the protein extract from ejaculated sperm and was present in a few forms (54, 220, >300 a >500 kDa). It was localised in the acrosomal region of ejaculated and capacitated sperm. It was not detected after acrosomal reaction.

Klíčová slova

protilátka, Western blot, imunofluorescence, povrchové proteiny

Keywords

Western blot, immunofluorescence, surface proteins, antibody

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 4. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / specializace:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie