Genes of innate immunity and their significance in evolutionary ecology of free living rodents

Mgr. Alena Fornůsková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Včasné rozpoznání patogenů je zásadní pro efektivní imunitní odpověď, zajišťující aktivaci adekvátních obranných mechanismů. U obratlovců je obecně zdokumentováno, že molekuly adaptivní imunity, které se účastní rozpoznání patogenů, jsou často předmětem intenzivních selekčních tlaků. Naopak mnohem méně údajů je známo o selekci působící na receptory vrozené imunity. Cílem této práce je popsat variabilitu genů vrozené imunity, které se účastní detekce patogenů u volně žijících hlodavců a odhalit, které selekční síly na ně během evoluce působily. Práce je zaměřena na podčeleď Murinae, jelikož často žijí v bezprostřední blízkosti lidí a jsou potencionálními nositeli různých pro člověka nebezpečných patogenů. Nejprve jsem studovala vnitrodruhovou variabilitu pěti anti-bakteriálních Toll-like receptorů (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 a TLR6) u inbredních linií myši domácí, které byly odvozeny z populací volně žijících zvířat. Tyto kmeny jsou vhodným nástrojem pro studování variability imunitních genů, jelikož nám poskytují informaci o alelách, které se v přirozené populaci vyskytují, a zároveň je možné vhodně využít homozygotních genotypů u inbredních jedinců. Výsledkem této části bylo popsání polymorfismu pěti genů TLR u dvou poddruhů myši domácí (Mus musculus musculus, Mmm a M. m. domesticus, Mmd). K nejzajímavějším výsledkům patřilo zjištění stop kodonu v exonu 2 u Tlr5 a nulová variabilita Tlr4 u Mmd. Tato část práce zároveň poskytla sadu diagnostických SNPs, které mohou být využity ke studiu introgrese Tlr genů přes hybridní zónu domácích myší a ke stanovení vlivu jejich polymorfismu na speciační procesy. Na tento výsledek jsme navázali další studií, kdy jsme se rozhodli ověřit, zda nízká variabilita Tlr4 u Mmd je reálným odrazem variability přírodních populací, či se jedná o nepřirozenou odchylku způsobenou nedostatečným vzorkováním či následným inbredním křížením. Osekvenovali jsme tedy Tlr4 u obou poddruhů z velké části jejich výskytu v západním Palearktu (celkem 39 Mmm a 62 Mmd) a srovnali variabilitu Tlr4 se znakem na mitochondriální DNA. Hlavním výsledkem bylo potvrzení hypotézy, že variabilita u Mmd je oproti Mmm opravdu radikálně snížena, pravděpodobně vlivem silné selekce způsobené patogeny, se kterými se během kolonizační cesty tento poddruh potkal. Vliv náhodných evolučních mechanismů (např. genetický drift při opakovaných sníženích efektivní velikosti populace) však nemůže být na základě našich dat zcela vyloučen. Dále jsme zjistili, že oba poddruhy mají zcela odlišné Tlr4 varianty, a že u Mmm je variabilita Tlr4 udržována i mechanismem rekombinace. Poslední část disertace je věnována mezidruhovému srovnání dvou receptorů (TLR4 a TLR7). Ty se liší jednak lokalizací v buňce a jednak schopností detekce odlišných ligandů. TLR4 patří mezi extracelulární receptory detekující hlavně bakteriální ligandy (především lipopolysacharidy), zatímco TLR7 je lokalizován na vnitrobuněčných membránách a detekuje ssRNA virů. Cílem mezidruhového srovnání bylo popsat variabilitu obou zmíněných receptorů a působení selekce během evoluce obou TLR. Celkem bylo pro analýzu použito 23 druhů hlodavců z podčeledi Murinae z Evropy, Asie a Afriky. Přestože se obě molekuly vyvíjejí především pod vlivem purifikující selekce, která eliminuje negativní mutace a udržuje funkčnost receptorů, některé jejich části vykazovaly znaky pozitivní selekce. Místa pod pozitivní selekcí byla koncentrována především v extracelulární části obou receptorů, která je zodpovědná za rozpoznání patogenů. Následným srovnáním obou TLR jsme zjistili, že intracelulární TLR7 je pod mnohem větším negativním selekčním tlakem,

Abstract:

neboť rozpoznává virové nukleové kyseliny, které jsou značně podobné hostitelským molekulám, a jakákoliv i drobná změna by mohla vést k autoimunitním poruchám.

Abstract:

Appropriate recognition of parasites is crucial for effective immune response, ensuring activation of adequate defence mechanisms. In vertebrates, it has frequently been demonstrated that genes encoding proteins involved in pathogen recognition by an adaptive immune system are often subject to intense selection pressures. On the contrary, much less information has been provided on the evolution of recognition mechanisms of innate immunity. The aim of this thesis is to describe the pattern of natural variation of innate immunity genes involved in pathogen recognition in rodents and to analyze the mechanisms of their evolution. We used murine rodents (subfamily Murinae) as a principal model group because they often live in our close proximity and thus are potential reservoirs of various pathogens dangerous to humans. First, We studied the intraspecific variability of five bacterial sensing Toll-like receptors (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, and TLR6) in inbred strains derived from two subspecies of the house mouse (M. m. musculus, hereafter abbreviated as Mmm and Mus musculus domesticus, Mmd). Wild-derived inbred strains are suitable tools for studying variation of immunity genes because they provide information about alleles that occur in natural populations, and at the same time they occur at homozygous state. The most significant results include the findings of a stop codon in exon 2 of the Tlr5 gene in one Mmm strain and no variability in Tlr4 of Mmd. The results also provide the set of diagnostic SNPs for each gene allowing future studies of introgression of immunity genes across the house mouse hybrid zone and their possible role in the speciation process. Following these results we decided to check whether the absence of Tlr4 polymorphism in Mmd reflects the pattern found in natural populations, or whether it is a consequence of insufficient sampling or subsequent breeding. We therefore sequenced Tlr4 in both subspecies across a large part of the Western Palearctic region (in total 39 Mmm and 62 Mmd individuals), then we compared these results with variability on mitochondrial DNA (cytochrome b). The result confirmed our prediction that observed variability in Mmd is strongly reduced also in free-living populations (compared to Mmm), probably due to strong purifying selection by pathogens with which they met during the westward colonization. However, the influence of random evolutionary processes (e.g. drift during bottlenecks) cannot be excluded based on our data. At the intraspecific level, we could not find any sign of positive selection. Our results revealed also species specific variants of Tlr4 and an important role of recombination in Mmm during evolutionary history. The last part of my dissertation is devoted to interspecific comparison of two receptors, TLR4 and TLR7. These two TLRs differ in the exposure and the ligands detection. TLR4 is an extracellular receptor detecting mainly bacterial ligands (especially lipopolysaccharides), while TLR7 is located inside the cell and detects ssRNA viruses. The aim of this part of the thesis was to describe variability of both receptors at the interspecific level and to reveal selection forces acting on TLRs in longer evolutionary time scale. In total we analyzed 23 rodent species of the subfamily Murinae in Europe, Asia and Africa. Our results suggest that purifying selection has been a dominant force in evolution of the Tlr4 and Tlr7 genes, but we also demonstrated that episodic diversifying selection has shaped the present species-specific variation in rodent Tlrs. Sites under positive selection were concentrated mainly in the extracellular domain of both receptors, which is responsible for ligand binding. The comparison between two TLRs lead us to the conclusion that the intracellular TLR7 is under much stronger negative selection pressure, presumably due to its interaction with viral nucleic acids, which are similar to those of the host and even small changes in TLR7 conforma

Abstract:

tion could cause autoimmunity.

Keywords

Toll-like receptors, receptors of innate immunity, Pattern Recognition Receptors, selection, evolution, natural selection, genetic polymorphism, phylogeny, host-parasite coevolution, genetic diversity

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 12. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 19. 12. 2013
• Supervisor: doc. Mgr. et Mgr. Josef Bryja, Ph.D.
• Reader: prof. MVDr. et RNDr. Petr Hořín, CSc., prof. Dirk Werling

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Zoology