Zavedenie metódy chromatínovej imunoprecipitácie pre analýzu epigenetických zmien chromatínu

Bc. Marián Hlavna, Ph.D.

Master's thesis

Implementation of Chromatin Immunoprecipitation Method for Epigenetic Chromatin Modifications Analysis

Abstract:

The purpose of this thesis was to implement chromatin immunoprecipitation (Ch-IP) method on the basis of the experimental treatment of Spinal muscular atrophy (SMA). Another aims was to study effects of histondeacetylase inhibitors (iHDAC), namely valproate (VPA), benzamide M344, scriptaid and other potential therapeutics – hydroxyurea and kinetin, on SMN2, Htra2-β1 and hnRNP-G and analyze valproate effects on gene expression in general, using mRNA microarray method. We accomplished the implementation and optimalization of Chromatin immunoprecipitation method on Department Centre of molecular biology and gene therapy. After our implementation this method is already successfully used as a tool for studying epigenetic effects of statin treatment. Using real-time PCR method we studied incidence of chosen histondeacetylase inhibitors, VPA and benzamid M344, on SMN2, Htra2-β1 and hnRNP-G gene expression level. We observed that after VPA and M344 treatment decreased level of mRNA of these studied genes. We treated SMA derived fibroblast cultures with iHDAC’s valproate, M344, scriptaid and other potential SMA therapeutics hydroxyurea and kinetin, and using western blot analysis and detection with antibodies we investigated the level of SMN protein after these treatments. We did not observed any significant effect of these potential SMA therapeutics on SMN protein level. We employed mRNA microarray analysis to determine effect of valproate on gene expression in general and we identified 12 candidate genes which may play role in VPA SMN independent therapeutical effect in SMA patients. Our results obtained using mRNA microarray should be evaluated using different independent methods (e.g real/time PCR).

Abstract:

Náplňou predkladanej diplomovej práce bolo zavedenie metódy chromatínovej imunoprecipitácie, na pozadí experimentálnej liečby spinálnej muskulárnej atrofie. Ďalšou úlohou bolo sledovať účinky vybraných inhibítorov HDAC – potenciálnych liečiv SMA, na úroveň expresie génov SMN2, Htra2-β1 a hnRNP-G a zároveň zmapovať účinky iHDAC Valproátu sodného pomocou mRNA čipovej analýzy. Na pracovisko Centra molekulární biologie a genové terapie vo Fakultnej nemocni bola úspešne zavedená a zoptimalizovaná metóda chromatínovej imunoprecipitácie. Táto metóda si už v súčasnosti na danom pracovisku našla svoje uplatnenie pri sledovaní účinkov statinov – liečiv používaných na znížovanie cholesterolu v krvi. Pomocou real-time PCR bolo sledované pôsobenie vybraných inhibítorov HDAC – valproátu sodného (VPA) a benzamidu M344 na úroveň expresie obecných zostrihových faktorov Htra 2 – β1 a hnRNP-G. Real-time PCR analýzou bolo zistené, že po pôsobení VPA a M344 dochádzalo k poklesu transkripcie oboch sledovaných génov. Western-blot analýzou a detekciou protilátkami boli u SMA fibroblastových kultúr sledované účinky vybraných iHDAC (VPA, M344 a scriptaid) a ďalších látok (hydroxyurea a kinetin) na hladinu proteínu SMN. Po pôsobení vyššie uvedenými látkami sme nepozorovali signifikantné zmeny v množstve proteínu SMN. umRNA čipovou analýzou boli zmapované účinky valproátu sodného na zmeny génovej expresie obecne. Boli vyhľadané kandidátne gény so zmenenou expresiou, ktoré by mohli naznačovať SMN nezávislé terapeutické účinky valproátu sodného.

Kľúčové slová

Chromatínová imunopreciptácia, Spinálna muskulárna atrofia, Inhibítor histondeacetyláz, Valproat sodný

Jazyk práce: Slovak

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 22. 6. 2009
• Vedúci: doc. RNDr. Lenka Fajkusová, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biology / Molecular Biology and Genetics