Vliv těžkých kovů na sekvenčně specifickou vazbu proteinů p63 a p73 k DNA

Mgr. Alena Pastuchová

Advanced ('rigorózní') thesis

Influence of heavy metals on sequence specific DNA binding of proteins p63 and p73

Abstract:

Mezi typické vlastnosti všech tří členů rodiny p53 (proteiny p53, p63 a p73) patří schopnost specifického rozpoznání cílových sekvencí na DNA. Vazba na DNA je nezbytná k funkci proteinů jako nádorových supresorů. Bylo zjištěno, že ionty těžkých kovů mohou ovlivnit konformaci p53 a jeho sekvenčně-specifickou vazbu k DNA, a potlačit tak jeho odpověď na poškození DNA. U iontů kadmia, kobaltu i niklu bylo prokázáno, že narušují různé mechanizmy reparace DNA. V naší práci jsme studovali, zda ovlivňují i funkci proteinů p63 a p73. Zkoumali jsme, jestli tyto kovy mohou ovlivnit sekvenčně-specifickou vazebnou aktivitu proteinů p63 a p73, ale i transaktivaci cílových genů rodiny p53. Inhibice sekvenčně-specifické vazby všech členů rodiny p53 ke konsenzní sekvenci (p53CON) byla studována pomocí gelové retardační analýzy. Narušení transaktivace promotorů BAX a MDM2 ionty kadmia bylo pozorováno pro p53, p63 i p73 prostřednictvím luciferázového reportérového testu. Vazba na specifickou DNA chránila centrální domény rodiny p53 před účinky kademnatých iontů. Kademnaté ionty měly výraznější vliv na p53 než na proteiny p63 a p73. Bylo zjištěno, že inhibice vazby rodiny proteinů p53 k DNA ionty kadmia je částečně reverzibilní pomocí EDTA. Činidlo DTT bylo schopno zvrátit inhibiční účinky iontů kadmia pouze u proteinů p53 a p73. Pro narušení interakce DNA-p53 kobaltnatými či nikelnatými ionty byly třeba sub-milimolární koncentrace těchto iontů, kdežto pro inhibici vazby DNA-p63 a DNA-p73 byly potřeba koncentrace milimolární.

Abstract:

Typical properties of all three p53 family members (p53, p63 and p73 proteins) include the ability to specifically recognize the target sequences on DNA. Binding to DNA is essential for the proteins function as tumor suppressors. It has been found that heavy metal ions can influence the p53 conformation and its sequence-specific binding to DNA, thus suppressing its response to DNA damage. The cadmium, cobalt and nickel ions have been shown to interfere with various DNA repair mechanisms. In our work, we studied whether they also affect the function of the p63 and p73 proteins. We investigated whether these metals could affect the sequence-specific binding activity of p63 and p73 proteins, but also the transactivation of p53 target genes. Inhibition of the sequence-specific binding of all p53 family members to the consensus sequence (p53CON) was studied by electrophoretic mobility shift assay. The transactivation disruption of the BAX and MDM2 promoters by cadmium ions was observed for p53, p63 and p73 by a luciferase reporter assay. The binding to specific DNA protected the p53 family central domains from the effects of cadmium ions. Cadmium ions had a more pronounced effect on p53 than on p63 and p73 proteins. Inhibition of p53 protein family binding to DNA by cadmium ions was found to be partially reversible with EDTA. The DTT was able to reverse the cadmium inhibitory effects only for p53 and p73 proteins. In order to disrupt the interaction of DNA-p53 with cobalt or nickel ions, sub-milimolar concentrations of these ions were required, while milimolar concentrations were required to inhibit the binding of DNA-p63 and DNA-p73.

Keywords

p53, p63, p73, rakovina, kadmium, kobalt, nikl, zinek, těžké kovy, sekvenčně specifická vazba DNA, rodina proteinů p53 p53, cancer, cadmium, cobalt, nickel, zinc, heavy metals, sequence specific DNA binding, p53 protein family

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 10. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 24. 1. 2018
• Reader: Mgr. Karel Lacina, Ph.D., Mgr. Marta Nekulová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Advanced ('rigorózní řízení') programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry