Využití techniky MLPA (multiplex ligation probe amplification) při studiu geneticky podmíněných onemocnění u člověka

Mgr. Eva Hladílková, Ph.D.

Doctoral thesis

Improvement technique MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) to study human genetic diseases

Abstract:

Strukturní chromozomové aberace (delece a duplikace) hrají jednu z hlavních rolí v patogenezi mnoha geneticky podmíněných onemocnění člověka a mj. představují i častou příčinu mentálních retardací (MR). V posledních několika letech bylo potvrzeno, že se na patogenezi MR významně podílejí chromozomové abnormality s rozsahem pod detekční hranicí klasické cytogenetické analýzy. Tyto tzv. copy number variants (CNVs, odchylky v počtu kopií) jsou běžně detekovány pomocí různých celogenomových platforem s vysokou rozlišovací schopností. Při těchto celogenomových vyšetřeních dochází často k identifikaci nových mikrodelečních nebo mikroduplikačních syndromů nebo vzácně i k objevení či upřesnění kandidátních nebo přímo kauzálních genů pro již známé onemocnění. MR se jako nevyléčitelné postižení objevuje u 2% nově narozených dětí. Vzhledem k tomu, že příčina tohoto onemocnění zůstává neobjasněna u více než 50% případů, je diagnostika MR a optimalizace jednotlivých laboratorních postupů jedním z nejčastějších zaměření genetického výzkumu. Právě díky rychlému rozvoji a zavádění nových technik molekulární cytogenetiky bylo zjištěno, že chromozomové aberace v subtelomerových oblastech jsou zodpovědné za postižení až u 5% případů idiopatické MR. Od roku 2002 patří k technikám umožňujícím odhalovat kryptické přestavby chromozomů i metoda MLPA. V předložené studii byl pomocí techniky MLPA vyšetřen soubor 233 pacientů s idiopatickou MR či opožděným vývojem, diagnostikovaných na Oddělení lékařské genetiky v letech 2007-2010. Prostřednictvím kitů MLPA P036 a P070, navržených pro detekci přestaveb v subtelomerických oblastech všech lidských chromozomů, byly odhaleny chromozomové aberace u 14/233 případů, což odpovídá záchytu 6%. Celkově bylo touto technikou nalezeno, 21 subtelomerických změn u 14 pacientů, tyto abnormality byly následně ověřeny a podrobně charakterizovány metodami FISH a array-CGH. Analýza a srovnání dostupných vzorků DNA pacientů a jejich rodičů prokázala, že čtyři aberace se objevily u pacientů de novo: dvě del(1)(p36) a dvě del(22)(p13). U šesti pacientů byly chromozomové abnormality zděděny po rodičích: dup(3)(q29), del(1)(p36) spojená s dup(12)(q24), dup(1)(p36) spojená s del(12)(q24), del(21)(q22) spojená s dup(11)(q24), dup(7)(q13) spojená s dup(19)(q13) a del(22)(q13), del(18)(p11). Ve čtyřech případech nebylo možné definovat původ aberací z důvodu chybějícího biologického materiálu: dup(4)(q32) spojená s del(7)(q35), dup(1)(p36), dup(17)(p13) spojená s del(22)(q13), del (16)(q24). V práci byla podrobně studována korelace nalezených genetických abnormalit s klinickými fenotypy. Na základě zkušeností a dílčích výsledků byla navržena a optimalizována strategie co nejefektivnějšího vyšetřování pacientů s neobjasněnou MR na Oddělení lékařské genetiky. Klasické cytogenetické vyšetření karyotypu (G-pruhování) zůstává prvním prováděným genetickým testem. MLPA zaujala stabilní místo při subtelomerickém a mikrodelečním skríninku. Technologií volby se v indikovaných případech stal celogenomový skrínink pomocí array-CGH. Cílená analýza pomocí metody FISH je s výhodou využívána při ověřování odhalených chromozomových změn během skríninku. Naše výsledky potvrdily, že metoda MLPA a její využití v rutinní laboratorní diagnostice je schopno zvýšit záchyt kauzálních chromozomových aberací postihující subtelomerické oblasti chromozomů, které by jinak zůstaly nezachyceny a které mohou být příčinou MR či opožděného vývoje pacientů. Byla prokázána spolehlivost, účinnost a finanční efektivnost metody MLPA, která se tak stala rutinní diagnostickou laboratorní metodou využívanou na Oddělení

Abstract:

lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno.

Abstract:

Unbalanced structural chromosomal aberrations (duplications and deletions) play a major role in the pathogenesis of many genomic diseases in human. Due to this fact, new high sensitive methods revealing gains and losses of the genetic material hold an important position in modern molecular-cytogenetics. Mental retardation (MR) as a permanent and incurable disease affects about 2% of newly born children. Because the cause of the MR is still unknown in an approximately half of the cases, MR has become a frequent focus of genetic research. Due to the development of sensitive molecular cytogenetic methods, it was proven that chromosomal aberrations in subtelomeric regions are responsible for idiopathic MR in up to 5% of the cases. Since 2002, an approach based on the classic PCR reaction in a conjunction with amplification of ligated probes (MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), has been developed for analysis of DNA sequences. As part of my dissertation, MLPA has been successfully implemented and optimized for subtelomeric screening into the clinical laboratory practice at the Integrated Laboratory of Molecular Cytogenetics, University Hospital Brno, in patients with unexplained MR and developmental delay (DD). The specific correlation genotype/phenotype was determined in 14 patients with detected chromosomal imbalances. It was proposed an algorithm for a diagnostic process in patient with unexplained MR/DD, dysmorphic features and congenital defects which is based on combination of all available diagnostic tools at Department of Medical Genetics according their cost-effectivity and reliability in our conditions. In this study, MLPA assay was used to search for pathogenic subtelomeric CNVs in a cohort of 233 patients with unexplained MR/DD. These patients have been investigated at the Department of Medical Genetics between years 2007 - 2010. My research was conducted by using the MLPA method with kits number P036 and P070, which are designed for subtelomeric screening. The chromosomal rearrangement was detected at 14 out of 233 cases. The detected CNVs can be divided into the following groups: clearly pathogenic CNVs that overlap known microdeletion syndromes (Microdeletion syndrome 1p36 - Cases 1, 4, 6 and the Microdeletion syndrome 22q13 - Cases 2, 3, 9, 13), CNVs that overlap pathological chromosomal region identified in other studies (in Cases 8, 11), potentially pathogenic CNVs (in Cases 5, 7, 12, 14) and polymorphic CNVs (in one incident - Case 10). Record of these changes (14/233) was 6%, which corresponds with the worldwide described detection rate of subtelomeric chromosomal aberrations in patients with unexplained MR/DD. This confirmed that MLPA revealed additional 6% of chromosomal aberrations, which could be cause of MR/DD. The use of MLPA it the clinical laboratory practice increased the detection rate of chromosomal aberrations and so the clarification of the causes of idiopathic MR/DD. However new genome-wide copy-number detection using array-CGH is becoming more effective for the investigation of patients with MR/DD, the implementation of this method into routine clinical laboratory practice still presents funding problems and challenge with the difficult clinical interpretation of the results. My study has shown MLPA to be an alternative diagnostic tool for the detection of cryptic CNVs for cytogenetic laboratories that have not (yet) access to more sophisticated array-based technology. In conclusion, my results show that the implementation of new techniques such as MLPA, coupled with array-CGH or FISH analysis to the routine diagnostic screening algorithm in patients with unexplained MR/DD, would definitely help in identifying of the subtelomeric chromosomal aberrations, which otherwise could be missed in the conventional G-banded karyotyping. MLPA takes main place in routine screening of subtelomeric changes as well as screening of the most frequent microdeletions in patients with negative G

Abstract:

-banding findings. Specialized high-resolution techniques are certainly more powerful tools in establishing the proper phenotype/genotype correlations and the determination of candidate genes. This helps to provide accurate genetic counselling to the affected families, also for an improved prevention and possible therapies in patients (physiotherapy, psychotherapy, and pharmacotherapy). Eventually, more families will be informed about the cause of the disease of their family member that allows targeted prenatal or preimplantation diagnostics. MLPA has become reliable and cost-effective diagnostic tool at the Department of Medical Genetics, University Hospital Brno. The subtelomeric screening by MLPA is now performed up to 60 patients with unexplained MR/DD or additional congenital abnormalities a year.

Keywords

chromosomal aberrations, mental retardation, molecular cytogenetics, MLPA, array-CGH

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 1. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 2. 3. 2012
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc.
• Reader: prof. MUDr. Petr Goetz, CSc., RNDr. Barbora Ravčuková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / General and Molecular Genetics