Analýza molekulárních markerů u lymfomů

Mgr. Lenka Štefančíková, Ph.D.

Doctoral thesis

Analysis of molecular markers in lymphomas

Anotácia:

Nehodgkinské lymfomy (NHL) jsou nádorová onemocnění buněk imunitního systému. Lymfom z buněk plášťové zóny (MCL) je nejméně častým leč nejagresivnějším typem z NHL. V nádorové tkáni téměř všech pacientů s MCL se objevuje translokace t(11;14), která způsobuje vysokou expresi cyklinu D1, důležitého regulátoru buněčného cyklu. Difúzní velkobuněčný B-lymfom (DLBCL) je ve skupině NHL nejčastějším. U obou těchto diagnóz se objevují mutace nádorového supresoru p53, který je u nádorů nejčastěji mutovaným genem vůbec. p53 hraje klíčovou roli při udržování integrity genomu. V reakci buňky na poškození DNA funguje jako transkripční faktor a spouští řadu buněčných drah, které vedou k zástavě buněčného cyklu, opravě poškození, k apoptóze či senescenci buněk. Zjišťovali jsme výskyt translokace t(11;14) a exprese cyklinu D1 (mRNA i proteinu) v nádorové tkáni 32 pacientů s MCL. U 30 z nich jsme tyto změny prokázali. Zachytili jsme 2 vzácné případy MCL, kteří se vyznačovali vysokou hladinou cyklinu D2. Onkogenní účinek cyklinu D1 může být u MCL nahrazen jiným cyklinem D. Podrobně jsme analyzovali status p53 v nádorové tkáni 33 pacientů s MCL a 75 pacientů s DLBCL. Funkční analýzou v kvasinkách následovanou sekvenací cDNA jsme určili mutace genu p53 (9, tj. 27 % u MCL a 16, tj. 21,3 % u DLBCL). Většina mutací byla typu jednonukleotidových záměn, našli jsme také delece 1, 10 a 18 nukleotidů a mutaci beze smyslu. Mutace jsme blíže charakterizovali. Prokázali jsme akumulaci proteinu p53 u všech MCL vzorků s mutací typu jednonukleotidových záměn, u DLBCL jsme vyšší hladinu proteinu p53 pozorovali také u vzorků s funkčním p53. Ztrátu lokusu 17p13.3 obsahující gen p53 jsme s využitím metody FISH pozorovali u 3 vzorků MCL s mutacemi p53. U DLBCL byl p53 deletován u 10 vzorků, 6 z nich obsahovalo mutaci p53. MCL pacienti s mutacemi p53 měli výrazně kratší celkové přežívání než pacienti bez mutace v tomto genu. Pozorovali jsme kratší přežívání do progrese a trend k horšímu celkovému přežívání u 46 de novo DLBCL pacientů s mutacemi a/nebo delecemi p53, kteří byli léčeni chemoterapií i rituximabem. Aberace p53 jsou důležitým prognostickým ukazatelem u obou typů lymfomů. Metodou FISH jsme sledovali deleci ATM, kinázy aktivované dvouřetězcovými zlomy v DNA. Delece byla častější u MCL než u DLBCL (45 % vs. 13,9 %), u DLBCL jsme pozorovali trend k lepšímu přežívání pacientů s delecí ATM.

Abstract:

Mantle cell lymphoma (MCL) is rare but the most aggressive subtype of B-cell non-Hodgkins lymphomas (NHLs), tumours originating from abnormal proliferation of B-cells. It is genetically characterized by the translocation t(11;14)(q13;q32) leading to cyclin D1 overexpression. Diffuse large B-cell lymphoma is the most frequent among NHLs. Mutations of the p53 tumor suppressor occur in about one fifth of patients with MCL and DLBCL. p53 is stress responding transcription factor which activates cellular pathways leading to cell cycle arrest, DNA repair, senescence, apoptosis and many others. For its key role in preservation of genomic integrity it is the most commonly mutated gene in human cancer. We assessed the presence of translocation and cyclin D1 overexpression (both mRNA and protein) in the tumor tissue of 32 MCL patients. In 30 of them we found those typical genetic changes. In two cases we proved overexpresion of cyclin D2 protein instead. MCL cases overexpresing cyclin D2 are rare and cyclin D2 may substitute for cyclin D1 in the pathogenesis of this disease. We provided complex analysis of p53 in tumor tissue of 33 MCL and 75 DLBCL patients. Using functional analysis of separated alleles in yeast (FASAY) and direct sequencing of cDNA we found 9 p53 mutations in MCL (27%) and 16 p53 mutations in DLBCL (21.3%). Most mutations were missense, besides them we found deletions of 1, 10 and 18 nucleotides respectively and one nonsense mutation. Presence of p53 missense mutation was associated with the p53 protein overexpression in MCL, contrary to DLBCL where we found also rare wt p53 cases overexpressing p53. We found the deletion of p53 allele in 3 cases of MCL (all having p53 mutated) and in 10 cases with DLBCL (6 had p53 mutation). Statistical analysis showed significant decrease in overall survival of patients with p53 mutations in MCL. de novo DLBCL patients treated with chemotherapy plus rituximab with p53 mutation and/or deletion (N=46) had significantly decreased progression free survival. Overall survival was also negatively influenced by these aberrations although the difference was not statistically significant. Further study and especially significant enlargement of group of analyzed cases are necessary to prove the negative impact of the p53 inactivation on prognosis in DLBCL. ATM is a central regulator of DSB responding pathway with important role in the development of B cells. We found higher frequency of ATM deletion in MCL (45%) compared to DLBCL (13.9%). DLBCL patients with ATM deletion tend to have better prognosis.

Kľúčové slová

lymfom z buněk plášťové zóny, velkobuněčný difúzní B-lymfom, cyklin D1, p53, ATM, FASAY

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 30. 3. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 27. 5. 2011
• Vedúci: prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
• Oponent: MUDr. Petr Müller, Ph.D., prof. RNDr. Marie Jarošová, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology