Obsah metabolitů ve spermiích ryb za různých fyziologických podmínek

MSc. Pavlo FEDOROV

Doctoral thesis

Fish spermatozoa metabolites content in various physiological conditions

Abstract:

Výzkum zapojení kreatinfosfátu a adenosyl fosfátů do metabolismu rybích spermií je pro spermatologii ryb vemi důležitý. Tyto sloučeniny jsou nezbytné k navození normálního fyziologického stavu a motility spermií. Souběžně probíhající změny obsahu kreatinu a adenylovaných fosfátů v rybích spermiích před a během motility nejsou zcela objasněny. Proto je velmi důležité studovat a vyvíjet nové metody kvantifikace kreatinu a adenylovaných fosfátů ve spermiích různých druhů ryb za fyziologických podmínek, jako je zrání a manipulace in vitro. Jedním ze studijních výstupů je vyvinutá metoda LC/HRPS (kapalinová chromatografie spojená se skenem produktů ve vysokém rozlišení) pro analýzu obsahu kreatinu a adenylovaných fosfátů v rybních spermiích (kapitola 2). Její hlavní výhodou je možnost detekce a kvantifikace několika sloučenin (kreatin, kreatinfosfát (CP), AMP, ADP, ATP a cAMP) současně s cílem získat maximální informace s vynaložením minimálního úsilí. Metoda byla ověřena při zohlednění takových klíčových parametrů, jako je mez kvantifikace, selektivita, výtěžnost a opakovatelnost. Představuje vynikající nástroj umožňující stanovení cílových sloučenin ve vysoce ředěných vzorcích spermatu ryb. Proto byla tato metoda použita pro kvantifikaci výše uvedených látek během procesu zrání spermií jesetera malého (Acipenser ruthenus) a při in vitro manipulaci se spermatem síha severníno mareny (Coregonus lavaretus maraena) a úhoře říčního (Anguilla anguilla). Tato studie ukázala, že nezralé spermie jesetera malého nejsou schopné iniciovat motilitu. Během jejich dozrávání bylo zjištěno průkazné snížení CP a stabilní hladiny ATP a ADP. Proto se předpokládá kritická důležitost systémů ATP regenerace a oxidativní fosforylace pro proces dozrávání spermií jesetera malého jako nezbytnosti úspěšného oplodnění (kapitola 3). Další experimenty ukázaly, že spermie úhoře říčního na počátku hormonálně indukované spermiace nebyly schopné iniciace motility aktivačním médiem (AM). Tuto schopnost však získaly ke konci hormonální stimulace. Toto doprovázelo zvýšení hladin CP a cAMP ve spermiích po aktivaci. To nám umožňuje předpokládat zapojení ATP regeneračního systému a cAMP-dependentních regulačních cest v procesu spermiace vyvolané hormonální stimulací. (kapitola 4). Současná studie představuje první úspěšné stanovení obsahu cAMP ve spermiích ryb během motility pomocí LC/HRPS. Vyvstaly důležité otázky týkající se krátkodobého uchování spermatu úhoře říčního. Obsah kreatinu, CP, AMP, ADP a ATP během krátkodobého uchování spermatu úhoře byl ovlivněn teplotou. Zjistili jsme významné snížení CP, ADP a ATP během skladování při 20 °C po jednom dni skladování na rozdíl od uchování při 4 °C. Současně se parametry motility statisticky nelišily při skladování při teplotě 4 °C a 20 °C až do sedmého dne uchování (kapitola 4). Získané výsledky by mohly přispět k rozvoji nových účinných metod pro zlepšení spermiace a krátkodobého skladování spermií v akvakulturním chovu úhoře. Různé stupně spotřeby energie v reakci na složení prostředí byly zjištěny u spermií síha severního marény. Spotřeba energie byla výrazně vyšší v podmínkách aktivace motility. V tomto procesu nebyl nalezen žádný vliv osmolality. Obsah CP a ATP byl významně vyšší, když byly buňky v médiu inhibujícím motilitu ve srovnání s aktivačním médiem. Nebyl nalezen žádný vztah mezi obsahem CP, ADP a ATP a parametry motility spermií v AM s různou osmolalitou. Izotonické podmínky upřednostňují spermie s delší dobou motility, vyšší linearitou a vyšší rychlostí bez zvýšení obsahu ATP (kapitola 5). To naznačuje, že řízení energetické účinnosti spermií

Abstract:

Investigation of creatine- and adenylate phosphates involvement in fish spermatozoa metabolism is of high interest for fish spermatology. These compounds are necessary to support normal physiological state and motility of spermatozoa. The simultaneous changes in content of creatine- and adenylate phosphates in fish spermatozoa prior and during their motility are quite unclear. Therefore, studying and development of new methods for the quantification of creatine- and adenylate phosphates in spermatozoa of different fish species under such physiological conditions as maturation and in vitro manipulation are of high importance. One of the study outputs is the developed LC/HRPS (liquid chromatography coupled with high resolution product scan) method for the analysis of creatine- and adenylate phosphates content in fish spermatozoa (Chapter 2). Its main advantage is the possibility to detect and quantify several compounds (creatine, creatine phosphate (CP), AMP, ADP, ATP, and cAMP) simultaneously to obtain maximum information with minimum analytical effort. The method was validated taking into account such key parameters as limit of quantification, selectivity, recovery and repeatability. It represented an excellent performance allowing determination of target compounds in highly diluted fish sperm samples. Consequently, the method was applied for the quantification of aforementioned substances during sterlet (Acipenser ruthenus) spermatozoa maturation and in vitro manipulation with sperm of whitefish (Coregonus lavaretus maraena) and European eel (Anguilla Anguilla). The present study showed that immature sterlet spermatozoa are not able to initiate motility. Significant decrease of CP and stable levels of ATP and ADP content during their maturation were found. The critical importance of ATP regeneration system and oxidative phosphorilation for the maturation process of sterlet sperm as a prerequisite for successful fertilization was assumed (Chapter 3). Further experiments revealed that European eel spermatozoa were not able to initiate motility by activation medium (AM) at the start of the induced spermiation. They acquired the ability to be activated after the dilution with AM at the end of hormonal treatment. This accompanied by the increase of CP and cAMP levels in spermatozoa after activation. That allowed us to assume the involvement of ATP regenerating system and cAMP-dependent regulatory pathways in the process of hormonally induced spermiation (Chapter 4). Current study represents a first successful estimation of cAMP in fish spermatozoa during the motility period using the LC/HRPS. Important issues concerning the short-term storage of European eel sperm were rised. Storage at 4 °C was accompanied by higher marcoergic phosphates content and higher motility in comparison to the storage at 20 °C. It suggests the involvement of macroergic phosphates metabolism in short-term storage. (Chapter 4). Obtained results could contribute to the development of new effective methods for improving of spermiation and short-term sperm storage in European eel aquaculture. Various degrees of energy consumption in response to environment composition were found in whitefish spermatozoa. Energy consumption was significantly higher in motility activating conditions. No effect of osmolality was found on this process. The content of CP and ATP was significantly higher when cells were in motility inhibiting medium comparing to activation medium. No relationship between content of CP, ADP, and ATP and spermatozoa motility parameters in AM of different osmolality was found. Isotonic conditions favor the spermatozoa with longer motility period, higher linearity, and fast velocity without increase in ATP content (Chapter 5). This suggests that whitefish sperm energy management is more efficient after activation in isotonic conditions. Obtained results are of high interest for elaboration of new sperm motility activating media for fisheries practice

Abstract:

síha severního marény je účinnější po aktivaci v izotonických podmínkách. Získané výsledky jsou velmi zajímavé pro přípravu nových médií pro aktivaci motility spermií pro rybářskou praxi..

Keywords

Spermatologie ryb, zrání spermií, bioenergetika spermií, makroergní fosfáty, Acipenser ruthenus, Anguilla anguilla, Coregonus lavaretus maraena, motilita spermií, shluková analýza, hmotnostní spektrometrie

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 8. 2017

Thesis defence

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery