Histone variant macroH2A1.1 enhances DNA repair and reprogramming efficiency of human iPSCs

Sebastiano Giallongo, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Abstrakt Úvod: Zachování genomové integrity je zásadním krokem při generování indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC- induced pluripotent stem cells) a zvýšení účinnosti opravy poškození DNA (DDR- DNA damage repair) by mohlo významně zlepšit účinnost přeprogramování v iPSC. Nicméně mechanismus, kterým DDR působí během přeprogramování somatických buněk, není zcela znám a plně objasněn. Metody: V této práci jsme hodnotili sestřihové izoformy histonové varianty macroH2A1, a to konkrétně varianty macroH2A1.1 a macroH2A1.2, jakožto potenciální regulátory DDR. Pro zjištění post-translačních histonových modifikací a vazebných/interagujících partnerů MacroH2A1 jsme zavedli do buněk HepG2 jeho sestřihové varianty označené mtagGFP, které jsme následně izolovali pomocí kuliček GFP-trap. Varianty macroH2A1.1 a macroH2A1.2 byly následně analyzovány pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie spřaženou s kapalinovou chromatografií. Pro zjištění funkce sestřihových variant macroH2A1 v procesu DDR, jsme tyto proteiny, označené zančkou mCerulean3, vnesli do reportérových buněk U2OS-GFP. Zapojení proteinu macroH2A1.1 do procesu DDR jsme rovněž zkoumali v in vivo knock-ot myším modelu. Pro zhodnocení fyziologické relevance našich dosažených výsledků jsme nadměrně exprimovali sestřihové izoformy macroH2A1 v endoteliálních buňkách lidské pupeční žíly (Human Umbilical Vein Endothelial Cells - HUVEC), které procházely buněčným přeprogramováním na iPSC. Výsledky: Identifikovali jsme poly-ADP ribózovou polymerázu 1 (PARP1) a X ray crosscomplementing protein 1 (XRCC1) jako exkluzivní interagující partnery macroH2A1.1. Overexprese MacroH2A1.1 značeného mCerulean3 v reportérových buňkách U2OS-GFP vedlo k výraznému zlepšení opravy DNA pomocí mechanismu nehomologního koncového spojování (NHEJ- Non-Homologous End-joining). Naopak, vyřazení (knock-out) MacroH2A1.1 v myších signifikantně zvýšilo bazální hladiny poškození DNA. Dále jsme potvrdili exkluzivní interakci proteinu macroH2A1.1, nikoliv ale macroH2A1.2, s komplexem PARP1/XRCC1 v buňkách HUVEC, které procházely buněčným přeprogramováním. Nadměrná over-exprese proteinu MacroH2A1.1-6His-tag v buňkách HUVEC vedla ke zvýšení DDR, jež následně zlepšilo schopnost přeprogramování směrem k Pi SC. Závěr: Celkově naše výsledky zdůrazňují významnou úlohu macroH2A1.1 jako epigenetického cíle pro zlepšení stability genomu iPSC s možným terapeutickým využitím.

Abstract:

Abstract Introduction: Genome integrity maintenance is essential for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSC) and increasing DNA damage repair (DDR) could significantly improve the efficiency of iPSC reprogramming. However, how DDR is orchestrated during somatic cell reprogramming has not been fully understood. Methods: In this work, we evaluated the splicing isoforms of histone variant macroH2A1, macroH2A1.1 and macroH2A1.2, as potential regulators of DDR. To identify post-translational modifications and to pin down putative binding partners of macroH2A1, we introduced mtagGFP tagged macroH2A1 splicing isoforms into HepG2 cells and we isolated them using GFP-trap. MacroH2A1.1 and macroH2A1.2 were subsequent analyzed using liquid chromatography tandem mass spectrometry. To investigate their role in DDR macroH2A1 splicing isoforms were introduced in U2OS-GFP reporter cells as mCerulean3 tagged proteins. MacroH2A1.1 role in DDR was also evaluated in a knock-out mice model. To evaluate the physiological outcome of our results we overexpressed macroH2A1 splicing isoforms in Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) undergoing cell reprogramming towards iPSCs. Results: we identified Poly-ADP Ribose Polymerase 1 (PARP1) and X-ray crosscomplementing protein 1 (XRCC1) as macroH2A1.1 exclusive interacting partners. MacroH2A1.1 overexpression as mCerulean3 tagged protein in U2OS-GFP reporter cells enhanced prominently Non-Homologous End-joining (NHEJ) DNA repair pathway. MacroH2A1.1 knock-out in mice increased their basal DNA damage levels. Next, we confirmed the exclusive interaction of macroH2A1.1, but not macroH2A1.2, with PARP1/XRCC1 in HUVEC undergoing cell reprogramming. MacroH2A1.1 overexpression as 6His-tag protein enhanced HUVEC DDR, thus improving iPSCs reprogramming. Conclusions: Overall, our results highlight the role of macroH2A1.1 as an epigenetic target to improve iPSC genome stability and therapeutic potential.

Keywords

\MacroH2A1.1, \poškození DNA, \buněčné přeprogramování, \iPSC. \MacroH2A1.1, \DNA damage, \cell reprogramming, \iPSC.

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 21. 12. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 28. 1. 2022
• Vedoucí: PhD. Manlio Vinciguerra
• Oponent: Assoc. Prof. Matthew J. Gamble, Ph.D., Benedetto Giaimo, Ph.D.

Masarykova univerzita

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biomedicínské vědy / Biochemie a molekulární biologie