Stanovení toxicity pomocí 3D sféroidů

Bc. Štěpánka Kozáková

Master's thesis

Determination of toxicity using 3D spheroids

Abstract:

Přeš veškerá varování je v současné době velmi rozšířen „špatný“ životní styl. Hlavní rysy jsou zejména špatné stravovací návyky, kouření, požívání alkolholu, zbytky chemických látek. Dále lidé často trpí stresem, tomuto a dalším agens, kterým je populace vystavována. Dochází k vyšší pravděpodobnosti vzniku nádorového onemocnění, které se tak řadí mezi druhou nejčastější přičinu úmrtí na světě. Léčba nádorového onemocnění spočívá převážně v chirurgických zákrocích v kombinaci s radioterapií či chemoterapií, které se stále zdokonalují. Přesto není pokrok ve vývoji léků a v léčebných přístupech úměrný k léčbě nádorového onemocnění. Z tohoto důvodu se začaly používat tzv. 3D modely v podobě organoidů nebo sféroidů, které oproti nejrozšířenějším 2D modelům dokážou lépe napodobit podmínky v lidském těle. Cílem této diplomové práce bylo sestavit kompaktní sféroidy z buněčných linií kolorektálních adenokarcinomů HT29 a Caco-2. A otestovat je také pomocí klasické 2D metody využívající tetrabromid. Na vytvoření sféroidů bylo izolováno pro každou jamku 1000 buněk na 100 µl dané buněčné linie. Takto byla destička centrifugována po dobu 5 minut a 400 otaček. Následně byla destička inkubována 72h v CO2 inkubátoru s 5 % CO2. Poté byla pořízena série fotek a byly přidány testované alkaloidy lykorin, heamanthamin, heamanthidin, montanin v koncentraci 5 - 0,625 µM a vinorelbin (0,07 - 0,009 µM) jako standard. Destička byla nechána v inkubaci 48h a opět změřena, následně bylo odebráno staré medium a nahrazeno novým, které opět obsahovalo testované látky v daných koncentracích. Toto se opakovalo po dobu 10 dní. Získané fotografie byly analyzovány pomocí programu ImigiJ a získaná data byla vyhodnocena v programu GrahpadPrism. Získané výsledky ukázaly, že lykorin (IC50 2,34 ± 0,41) přesto, že vykazoval jednu z nejnižších hodnot IC50, nemá výraznou schopnost inhibovat růst sféroidu při nejnižší koncentraci 0,625 µM. Naproti tomu u heamanthaminu, u kterého hodnota IC50 byla poměrně vysoká (IC50 4,84 ± 0,29), byla schopnost prostupovat a zpomalovat růst sféroidu i při koncentraci 0,625 µM o 40 %. Dále montanin byl při dané koncentraci schopný výrazně zpomalit růst sféroidů, a to o 20 %. U vinorelbinu byl zaznamenán u koncentrací 0,07; 0,039; 0,019 µM rozpad sféroidu ve druhém potažmo čtvrtém dnu působení daných koncentrací. U koncentrace 0,009 µM byl zaznamenám v osmém až desátém dnu trend začínajícího rozpadu sféroidu a uvolňování jednotlivých buněk. Při porovnání získaných výsledků 2D a 3D modelů je patrný výrazný rozdíl mezi tím, které látky jsou skutečně funkční a mají schopnost ovlivňovat buněčný růst ve vícero vrstvách. Je zde předpoklad, že při dlouhodobějším vystavení testovaných látek by mohl být růst výraznější, případně úprava chemické struktury testovaných alkaloidů by mohla vést ke zvyšení jejich účinnosti v zastavení buněčného růstu.

Abstract:

Despite all the obvious warnings, "bad" lifestyle is widely spread nowadays. The main features being poor eating habits, smoking, alcohol consumption or chemical residues. Furthermore, people often suffer from stress. These agents among many others to which the population is exposed, are more likely to contribute to the developpement of cancer, the second most common causes of death in the world. The treatment of cancer consists mainly of surgical procedures in combination with radiotherapy or chemotherapy, these are constantly being improved. Nevertheless, progress in medicine development and treatment approaches is disproportionate to the treatment of cancer. For this reason, the so-called 3D models in the form of organoids or spheroids have begun to be used. These 3D models which can, in contrast to the most spread 2D models, imitate the conditions in human body better. The aim of this thesis is to assemble compact spheroids to form HT29 and Caco-2, and test them by implementing the basic 2D method using tetrabromide. For creating spheroids, 1000 cells per 100 µl of a given cell line were isolated each dimple. Therefore, the plate is centrifuged 300 times, each time for 5 minutes. After that, the plate is incubated for 72 h in a CO 2 incubator with 5 % CO2. Subsequently, a series of photos were taken and the tested alkaloids lycorin, heamathine, heamathadine, montanine at a concentration of 5 - 0.625 µM and vinorelbine (0.07-0.009 µM) were added as a standard. The plate is then incubated for 48 hours and measured again, followed by removal of the old medium and its replacement by a new one, which again contained the test substances of defined concentrations. This is being repeated for 10 days. Obtained photographs are analyzed by using the ImigiJ program and data is evaluated in the GrahpadPrism program. Retrieved results showed that lycorin (IC50 2,34 ± 0,41), although showing one of the lowest IC50 values, does not have a significant ability to inhibit spheroid growth at the lowest concentration 0,625 µM. On the contrary, for heamathine, which had a relatively high IC50 value (IC50 4,84 ± 0,29), the ability to permeate and retard spheroids growth was even at the concentration of 0.625 µM by 40 %. Montanin with defined concentration was able to significantly slow down the growth of spheroids by 20 %. Vinorelbine was observed with concentrations of 0.07; 0.039; 0.019 µM breakup of spheroid in the second and fourth day with defined concentrations. At concentration of 0.009 µM, trend of early spheroid breakup and release and release of individual cells was recorded on days 8 to 10. When comparing the obtained results of 2D and 3D models is evident, a significant difference is evident in actual function and ability to influence cell growth in several layers for various substances. It is presumed, that prolongation of the exposure of tested substances could lead to more pronounced growth. Prospectively, a modification of the chemical structure of tested alkaloids could result in increase of their effectiveness in cell growth inhibition.

Keywords

3D sféroid, buněčné linie, toxicita, Caco-2, HT29, alkaloidy Amaryllidaceae

Keywords

3D spheroids, cell lines, toxicity, Caco-2, HT29, alkaloids Amaryllidaceae

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Ivo Doskočil, Ph.D.
• Reader: Ondřej Ženata, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme:
Food and Nutrition