Spatial and temporal characterization of DNA replication in plants.

Mgr. Alžběta NĚMEČKOVÁ

Doctoral thesis

Abstract:

DNA replication is a fundamental process necessary for the growth and development of all living organisms. Genetic information is replicated during the S phase of the cell cycle. The whole process is under strict control to ensure that replication takes place only once per the cell cycle. DNA replication has been intensively studied in yeast and animals. Unfortunately, information about the replication process in plants is still limited. The present thesis is focused on replication in seven economically important crop species belong to the Poaceae family, which differ in many characteristics such as genome size, repetitive DNA sequences content, and their genome organization, number, and morphology of chromosomes, and chromosome orientation in interphase nuclei. Previous studies were based on the use of 5-Bromo-2'- deoxyuridine (BrdU) to visualize the genome region which undergoes DNA replication. This thymidine analog incorporates into the newly synthesized DNA strand during replication. Its visualization is time-consuming and requires DNA denaturation and specific antibodies that bind to BrdU. In the framework of this thesis, usage 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) was optimized. EdU is also incorporated into the newly synthesized DNA strand and visualized using fluorochrome(s) without the denaturation step. Fluorochrome labeling made it possible to distinguished nuclei that pass the cell cycle. EdU labeling followed by flow cytometry analysis then enables to study course of the DNA replication process,and in combination with flow sorting of nuclei representing different phases of the cell cycle played this approach a key role in the present study. Cell nuclei representing G1, G2, and early, middle, and late S phase were used for threedimensional fluorescent in situ hybridization (3D FISH), which allowed visualization of telomeric replicating regions together with specific immunolabeling (3D) of centromere regions with the aim to study their replication timing. At the same time, 3D analysis of the spatial arrangement of specific DNA regions (centromere,telomere) at different stages of the plant cell cycle was analyzed. Detailed analysis of chromatin structure is influenced by the denaturation step during visualization of DNA sequences localized using a standard FISH approach, which can alter the native structure of the chromatin. Within the framework of this thesis, we focused on an alternative, recently described CRISPR-Cas9 method, which enables fluorescent visualization of specific DNA sequences without denaturation. The method, called RGEN-ISL (Ishi et al., 2019), has been successfully optimized for maize Knob repeat, and a new approach allowing the simultaneous and specific visualization of proteins, DNA repeat, and sites of DNA replication in situ has been developed.

Abstract:

Replikace DNA je proces nezbytný pro růst a vývoj všech živých organismů. Genetická informace je replikována v průběhu S fáze buněčného cyklu. Celý proces probíhá pod přísnou kontrolou, aby k replikaci došlo pouze jednou v průběhu buněčného cyklu. Dosud byl proces replikace DNA intenzivně studován u kvasinek a živočišných buněk, u rostlin byl tento proces podrobně popsán teprve nedávno, a to u dvou druhů s velmi malým a středně velkým genomem - Arabidopsis thaliana a Zea mays. Informace o průběhu replikace rostlin, především těch s velkým genomem, jsou tak stále předmětem studia. Předkládaná disertační práce je zaměřena na studium DNA replikace u sedmi vybraných rostlin, které se řadí do čeledi lipnicovité (Poaceae), a které se liší v mnoha vlastnostech, ať už se jedná o velikost genomu, množství repetitivních sekvencí DNA a jejich organizaci v genomu, počet a morfologie chromozómů či uspořádání chromozomů v interfázním jádře. Dřívější práce využívaly pro studium replikace 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU). Tento analog tymidinu, inkorporující se v průběhu replikace do nově vznikajícího vlákna DNA, je možné vizualizovat použitím specifických protilátek, které se na BrdU navazují. Vizualizace BrdU však vyžaduje denaturační krok, který negativně ovlivňuje strukturu chromatinu. V průběhu doktorské práce byl pro analýzu průběhu replikace využití tymidinový analog 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), který se stejně jako BrdU inkorporuje do nově vznikajícího vlákna DNA, a je vizualizován fluorochromy bez použití 8 denaturace. Následná analýza pomocí průtokové cytometrie umožňuje studovat průběh DNA replikace a identifikovat buněčná jádra procházející různými fázemi buněčného cyklu. Možnost oddělit jednotlivé fáze buněčného cyklu byla klíčovou a za pomocí průtokového cytometru byly získány jednotlivé frakce buněčného cyklu: G1, G2, počáteční, střední a konečná fáze S fáze. Získaná jádra byla použita pro třídimenzionální fluorescenční in situ hybridizaci (3D FISH), která umožnila vizualizovat telomerické oblasti DNA podléhající replikaci, společně s cetromerickými oblastmi vizualizovanými pomocí imunolokalizace v trojrozměrném prostoru buněčného jádra. Použití konfokální mikroskopie a umožnilo, na základě překryvů centromer a telomer s replikujícím se chromatinem (značený pomocí EdU), vyhodnotit časový průběh replikace. Výsledkem této komplexní studie je popis časového průběhu replikace centromerických a telomerických oblastí. 3D analýza zároveň umožnila studovat prostorové uspořádání chromozómových oblastí (centromera-telomera) v různých fázích buněčného cyklu rostlin. Detailní analýza struktury chromatinu naráží na problém denaturace, která je nezbytným krokem v průběhu vizualizace specifických oblastí pomocí standardní FISH metody, čímž může dojít ke změně přirozené struktury chromatinu. Dalším dílčím cílem dizertační práce proto byla optimalizace alternativní, nedávno popsané metody CRISPR-Cas9, která mimo jiné umožňuje i fluorescenční vizualizaci specifických sekvencí DNA a to bez použití denaturačního kroku. Metoda, s názvem RGEN_ISL (Ishi et al., 2019), byla s úspěchem optimalizována na kukuřici se sondami specifickými pro Knob oblast a byl vypracován nový přístup nedenaturující kombinace barvení, který umožňuje studovat specifickou sekvenci DNA, průběh její replikace a také epigenetické modifikace in situ.

Keywords

replikace DNA, EdU, S faze, třidimenzionální fluorescenční in situ hybridizace, Rablova konfigurace, immunolokalizace, CRISPR/Cas9

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 10. 2020

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Eva Hřibová, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology