Využití různých typů povrchově modifikovaných magnetických nanočástic pro izolaci a purifikaci bakteriální DNA/RNA

Bc. Eliška Bednářová

Master's thesis

The use of different types of surface modified magnetic nanoparticles for isolation and purification of bacterial DNA/RNA

Abstract:

V předložené závěrečné práci „Využití různých typů povrchově modifikovaných magnetických nanočástic pro izolaci a purifikaci bakteriální DNA/RNA“ byly využity magnetické částice, které byly povrchově modifikovány tetraethoxysilanem (TEOS) a (3-aminopropyl)triethoxysilanem (APTES). Cílem bylo optimalizovat protokol izolace nukleových kyselin pomocí magnetických částic z gram negativních i gram pozitivních bakterií, aby se dosáhlo co nejvyšší výtěžnosti RNA. V teoretické části práce byla shrnuta struktura a složení bakteriálních buněk, především složení buněčné stěny, díky které se bakterie rozdělují na gram pozitivní a gram negativní. Dále byly uvedeny jednotlivé možnosti detekce bakterií, které se využívají v klinické praxi. Při detekci bakterií pomocí molekulárních metod je často zásadním krokem izolace nukleových kyselin. Jednou z metod izolace je izolace pomocí magnetických částic, u které byl vysvětlen princip. U magnetických částic bylo popsáno složení a využívané funkcionalizace částic pro izolace nukleových kyselin. V praktické části práce byly magnetické částice nejprve charakterizovány několika metodami z důvodu specifikace jejich vlastností. Mohly tak být vybrány nejvhodnější částice pro izolace nukleových kyselin. Dále byly částice použity na optimalizace protokolu izolace nukleových kyselin z buněčného lyzátu, kdy se nejvíce osvědčil lyzační pufr s 30% detergentem Triton X-100, který měl podobné výsledky jako 30% detergent EcoSurf. Následovně byla hledána metoda efektivní lýzy bakteriálních buněk. Bylo využito několik metod, nejlepších výsledků dosáhla mechanická homogenizace zirkonovými kuličkami o velikosti 0,1 mm v kombinaci s lyzačním pufrem s 1% detergentem EcoSurf. Výtěžnost RNA z izolací pomocí magnetických částic byla porovnána s izolací pomocí kolonkové metody, přičemž byl na izolace použit komerční izolační kit. Pomocí kolonkové metody bylo dosaženo výtěžnosti RNA u S. aureus přibližně 350 ng/µl, při použití magnetických částic tomu bylo o 70 ng/µl méně. Výtěžnost RNA za pomoci komerčních pufrů byla značně vyšší než při použití vlastních pufrů, proto by bylo vhodné dále optimalizovat protokol izolace a složení vlastních pufrů při izolaci nukleových kyselin. Magnetické částice s modifikací TEOS i APTES mají velký potenciál pro využití při izolacích nukleových kyselin z bakterií.

Abstract:

In the submitted thesis "The use of different types of surface modified magnetic nanoparticles for isolation and purification of bacterial DNA/RNA", magnetic nanoparticles modified with tetraethoxysilane (TEOS) and (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) were used. The aim was to optimize the nucleic acid isolation protocol using magnetic particles from both gram negative and gram positive bacteria in order to achieve the highest possible RNA yield. In the theoretical part of the thesis, the structure and composition of bacterial cells were summarized, especially the composition of the cell wall, which allows the bacteria to be divided into gram positive and gram negative. Furthermore, the different options for bacterial detection used in clinical practice were presented. Nucleic acid isolation is often an essential step in the detection of bacteria using molecular methods. A method based on magnetic particles is one of them, and the principle was explained here. The composition and functionalisation of the particles used for nucleic acid isolation have been described. In the practical part of the thesis, magnetic particles were characterized by several methods to specify their properties. Thus, the most suitable particles for nucleic acid isolations was selected. Next, the particles were used to optimize the procedure for nucleic acid isolation from cell lysate. The lysis buffer with 30% Triton X-100 detergent was determined to be the most effective and similar results were obtained with the 30% EcoSurf detergent. Subsequently, a method for efficient bacterial cell lysis was optimalized. Several methods were used and the best results were achieved by mechanical homogenization with 0.1 mm zirconia beads in combination with lysis buffer with 1% EcoSurf detergent. RNA yields from isolations by magnetic particles were compared with those from column isolations using a commercial isolation kit. Approximately 350 ng/µl of RNA yield was achieved for S. aureus using the column method, while 70 ng/µl less was achieved using magnetic particles. RNA yields were significantly higher than those using custom buffers, therefore, further optimization of the isolation protocol and composition of custom buffers in nucleic acid isolation would be advisable. Magnetic particles with both TEOS and APTES modifications have great potential for use in the isolation of nucleic acids from bacteria.

Keywords

magnetické nanočástice, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, EcoSurf, kvantitativní polymerázová řetězová reakce

Keywords

Staphylococcus aureus, magnetic nanoparticles, Escherichia coli, EcoSurf, quantitative polymerase chain reaction

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 4. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 30. 5. 2023
• Supervisor: Ing. Jiří Kudr, Ph.D.
• Reader: Tomáš Lednický, externi

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Master programme / specializace:
Molecular Biology and Biotechnology / Animal Molecular Biology and Biotechnology