Antimikrobiální aktivita bifidobakterií proti Clostridium perfringens a Clostridium difficile

Bc. Vendula Bartošáková

Master's thesis

Antimicrobial activity of bifidobacteria against Clostridium perfringens and Clostridium difficile

Abstract:

Diplomová práce je zaměřena na identifikaci konkrétních druhů bifidobakterií, produkujících antimikrobiální látky, jež potlačují růst nežádoucích střevních patogenů. V teoretické části je podrobněji popsána střevní mikrobiota člověka a s ní spojené infekce trávicího ústrojí, kdy původci onemocnění jsou patogeny z rodu Clostridium. Dále je zde popsána problematika bifidobakterií, které by bylo možné navrhnout jako probiotické bakterie v možnostech prevence a podpory léčby proti gastrointestinálním onemocněním. Hlavním cílem této práce bylo nalezením vhodných kmenů z rodu Bifidobacterium, které by mohly vykazovat antimikrobiální aktivitu proti Clostridium perfringens a Clostridium difficile. Praktická část je složena ze tří experimentů. V první části byla pomocí diskové difúzní metody sledována antimikrobiální aktivita kmenů bifidobakteríí k jednotlivým kmenům klostridií, které se chovají jako patogeny v trávicím traktu. Celkem bylo otestováno 12 kmenů (4 druhy) z rodu Bifidobacterium. Pouze u čtyř kmenů Bifidobacterium animalis subsp. animalis a Bifidobacterium choerinum byla potvrzena antimikrobiální aktivita vytvořením jasných inhibičních zón. Součástí byla i detekce času, v němž dochází k produkci antimikrobiální látky. Dva kmeny vykazující antimikrobiální aktivitu byly přeočkovány a kultivovány. Během kultivace byly odebírány vzorky každé 2 hodiny a opět testovány deskovou difúzní metodou. Bylo zjištěno, že testované kmeny bifidobakterií vykazují stále stejnou antimikrobiální aktivitu. Tato aktivita byla detekována ve stejné míře ihned po přeočkování a i po 36 hodinách kultivace. Z toho vyplývá, že proti klostridiím pravděpodobně funguje látka obsažená v zamraženém médiu. Při použití supernatantů se zamražených vzorků byla navíc antimikrobiální aktivita nejvyšší. Druhá část je věnována testování supernatantů s upravenými vlastnostmi. Je tvořena třemi dílčími pokusy. V prvním případě byla otestována tepelná stabilita pozitivních supernatantů při teplotě 100 °C po dobu 30 minut. V druhém případě byl ověřen vliv změny při hodnotách pH 2, 7, 9. V posledním případě byl otestován přídavek proteinázy K v koncentraci 0,1 mg /1 ml. Bylo zjištěno, že změna teploty a přídavek proteinázy K nemají žádný vliv na antimikrobiální aktivitu bifidobakterií. Pouze při okyselení supernatantu na hodnotu pH 2 došlo k vytvoření znatelně větší inhibiční zóny. Třetí část je taktéž tvořena dvěma dílčími pokusy. Nejprve byly testovány dva vzorky bifidobakterií s pozitivním účinkem pomocí speciálního filtru, aby došlo k separaci případně přítomných proteinů, čímž bylo zjištěno, že se pravděpodobně jedná o látku proteinové povahy. Při druhém pokusu došlo k přídavku tweenu v koncentraci 1 % do modifikovaného Wilkins-Chalgren anaerobic média za účelem podpoření antimikrobiální aktivity a vytvoření většího množství testovaného produktu. Přídavek však neměl žádný vliv na antimikrobiální aktivitu. Z výsledků tohoto testování vyplývá, že některé testované supernatanty druhů B. animalis subsp. animalis a B. choerinum vykazují antimikrobiální aktivitu proti C. perfringens a C. difficile. Nicméně se může také jednat o produkt glycerolu, který je součástí zamražovacího média, kde může být přítomen akrolein, u něhož je znám antimikrobiální efekt.

Abstract:

Master´s thesis is focused on the identification of specific species of Bifidobacterium, that produce antimicrobial substances and those suppress the growth of undesirable intestinal pathogens. Theoretical part describes human intestinal microbiota and its associated infections of the digestive tract, where the origins of the disease are pathogens of the genus Clostridium. Further, there is a description of the issue of bifidobacteria, which could be suggested as a probiotic bacteria for the prevention and promotion of treatment of gastrointestinal disease. The main objective of this thesis was to find suitable strains of the genus Bifidobacterium, which might evince antimicrobial activity against Clostridium perfringens and Clostridium difficile. The practical part consists of three experiments. In the first part, an antimicrobial activity of strains of Bifidobacterium to individual strains of clostridia was monitored by disc diffusion method, that behaves like pathogens in the gastrointestinal tract. Totally, there were 12 strains (4 kinds) of the genus Bifidobacterium tested. Only 4 strains of genus Bifidobacterium animalis subsp. animalis and Bifidobacterium choerinum showed the antimicrobial activity confirmed by formation of clear inhibition zones. Tests also included a time detection, which leads to the production of antimicrobial substances. Two strains exhibiting antimicrobial activity were inoculated and culivated. During the cultivation samples were taken every 2 hours and again tested by disc diffusion method. It was found that the tested strains of bifidobacteria show always the same antimicrobial activity. This activity was detected in equal measure immediately after the inoculation, and even after 36 hours of cultivation. This testing show that against to clostridia probably functions substance contained in frozen medium. Moreover a supernatants from frozen samples were able to produce also the highest antimicrobial activity. The second part is dedicated to testing supernatants with modified properties. It consists of three part tests. In the first case the thermal stability of positive supernatants at 100 °C for 30 min was tested. In the second case, the effect of changes at pH 2, 7, 9 was verified. In the last case, the addition of proteinase K to 0,1 mg / 1 ml was tested. It was found, that the change in temperature and addition of proteinase K had no effect on the antimicrobial activity of Bifidobacterium, only the acidification of the supernatant to value pH 2, made considerably larger inhibition zones. The third part also consists of two part tests. First, two samples of Bifidobacterium with positive effects were tested using a special filter in order to separate present proteins, whereby it was found that the material had a protein nature probably. In the second experiment a tween in a concentration of 1% was added to the modified Wilkins-Chalgren anaerobic medium to enhance the antimicrobial activity. However, the addition had no effect on antimicrobial activity and making more test product. The results of this testing showed, that some from tested supernatants of B. animalis subsp. animalis and B. choerinum exhibit antimicrobial activity against C. perfringens and C. difficile. However, it may be a product of glycerol, which is part of the frozen media, there can be present an acrolein, which is known for antimicrobial effect.

Keywords

Klostridie, bifidobakterie, inhibice, antimikrobiální aktivita, bakteriociny

Keywords

bifidobacteria, inhibition, Clostridia, antimicrobial activity, bacteriocins

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Věra Bunešová, Ph.D.
• Reader: Jana Smolová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Nutrition and Foodstuffs / Nutrition and Foodstuffs