Subchloroplastové frakce a jejich izolace

Lucie HRABCOVÁ

Bachelor's thesis

Izolation of sub-chloroplast membrane particles

Anotácia:

Práce obsahuje základní informace o vnitřní struktuře chloroplastů a je věnována metodám izolace subchloroplastových částí (především granálních a stromálních tylakoidů). V experimentální části práce je uvedena metoda izolace tylakoidních membrán z rostlin špenátu, huseníčku a ječmene a následné solubilizace membrán pomocí detergentu digitoninu (v poměru 1:1 digitonin:celkový obsah chlorofylů a a b). Solubilizované tylakoidní membrány byly následně pomocí vysokootáčkové centrifugace separovány na frakce granálních tylakoidů (při 10 000 g 30 minut) a pomocí ultracentrifugace na okrajové části gran (při 50 000 g 30 minut) a stromální tylakoidy (při 130 000 g 60 minut). Izolované frakce byly charakterizovány pomocí poměru chlorofylu a a chlorofylu b (Chl a/b), nízkoteplotních fluorescenčních emisních spekter (při 77 K) a bezbarvé nativní elektroforézy (CN-PAGE). Ve všech případech vykazovaly granální frakce pokles poměru Chl a/b ve srovnání s izolovanými tylakoidními membránami, a naopak vzrostl poměr Chl a/b u stromálních frakcí ve srovnání s granálními tylakoidy (z hodnot 2,5 na 6,3 v případě rostlin špenátu). Pokles zastoupení komplexů fotosystému II (PSII) ve stromální frakci potvrdily výsledky fluorescenčních emisních spekter (pokles emise F685 a F695 vzhledem k F735) a bezbarvé nativní elektroforézy (nižší zastoupení superkomplexů PSII, dimerů a monomerů PSII, a především světlosběrných komplexů v trimerní formě).

Abstract:

The work contains basic information about the internal structure of the chloroplasts and is focused on methods of isolation of the subchloroplast parts (especially grana and stroma thylakoids). The experimental part of the work presents a method of isolation of thylakoid membranes from spinach, Arabidopsis and barley plants and subsequent solubilization of the membranes using digitonin (ratio 1:1 digitonin: total chlorophyll a and b). Solubilized thylakoid membranes were subsequently separated into grana fractions (at 10,000 g for 30 minutes) and by ultracentrifugation to the margins of the grana (at 50,000 g for 30 minutes) and the stroma thylakoids (at 130,000 g for 60 minutes). The isolated fractions were characterized by the ratio of chlorophyll a to chlorophyll b (Chl a/b), low-temperature fluorescence emission spectra (at 77K) and colorless native electrophoresis (CN-PAGE). In all cases, the grana fractions showed a decrease in the Chl a/b ratio compared to the isolated thylakoid membranes and conversely the Chl a/b ratio increased in the stroma fractions compared to the grana thylakoids (from 2,5 to 6,3 in the case of spinach plants). Decrease of the proportion of photosystem II (PSII) in the stroma fraction was confirmed by the results of the fluorescence emission spectra (decrease in F685 and F695 emissions relative to F735) and colorless native electrophoresis (lower proportion of PSII supercomplexes, PSII dimers and monomers, and especially light-harvesting complexes in trimeric form).

Kľúčové slová

chloroplast, izolace, ultracentrifugace, detergenty, absorpční spektrofotometrie, bezbarvá nativní elektroforéza

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 21. 6. 2022

Zverejniť od: 31. 12. 2999

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 26. 8. 2022
• Vedúci: Mgr. Irena Kurasová, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Bachelor programme / odbor:
Physics / Biofyzika