Použití rostlinných virů pro transientní expresi

Ing. Jakub Dušek

Doctoral thesis

The use of plant viruses for transient expression

Abstract:

Předkládaná doktorská disertační práce se zabývá transientní expresí proteinů v rostlinách pomocí virových vektorů. Sledování průběhu exprese bylo usnadněno použitím reportérových genů, zejména fluorescenčních. Byly použity reportéry GFP, DsRed a GUS. Expresní konstrukty byly vytvořeny na základě tobamoviru TMV (virus mozaiky tabáku) a geminiviru BeYDV (virus žluté zakrslosti fazolu). U konstruktů odvozených od BeYDV byl sledován vliv přítomnosti replikačního/replikačního asociačního proteinu (Rep/RepA) v cis/trans konfiguraci na sílu exprese. Kromě silného konstitutivního promotoru 35S byly vytvořeny plazmidy obsahující dva různé, chemicky indukovatelné, promotory 5xM a LexA. Ty aktivují expresi v rostlinách N. benthamiana u markerových genů nebo Rep/RepA po přidání příslušných aktivačních chemikálií. Virové vektory byly detekovány pomocí PCR, fluorescenční a elektronové mikroskopie. Jedním z cílů práce bylo i vytvoření RNA-proteinových VLP částic. Proběhla i úspěšná sekundární inokulace rostlin pomocí vytvořených VLP. V rámci této práce byla rozšířena současná klonovací strategie GoldenBraid o 4 nové destinační plazmidy, které urychlují, usnadňují a zlevňují tvorbu komplexnějších, vícegenových konstruktů. Z dat získaných v této části práce vznikla vědecká publikace, a plazmidy byly uloženy v depozitáři Addgene aby byly dostupné všem uživatelům.

Abstract:

This dissertation deals with the transient expression of proteins in plants using viral vectors. Monitoring the progress of expression was facilitated by the use of reporter genes, particularly fluorescent genes, namely GFP, DsRed and GUS reporters were used. The expression constructs were based on TMV tobamovirus (tobacco mosaic virus) and BeYDV geminivirus (bean yellow dwarf virus). The effect of the presence of Rep/RepA proteins (Rep/RepA) in the cis/trans configuration on expression levels was investigated for the BeYDV-derived constructs. In addition to the strong constitutive 35S promoter, plasmids were generated containing two different chemically inducible promoters - 5xM and LexA. These promoters drive marker or Rep / RepA gene expression upon the addition of appropriate activating chemicals in N. benthamiana plants. The viral vectors were detected by PCR, fluorescence and electron microscopy. One of the aims of the work was to generate RNA-protein VLPs. Successful secondary inoculation of plants with established VLPs was also carried out. As a part of this work, 4 new target plasmids were added to the current GoldenBraid cloning strategy, making the creation of more complex multi-gene constructs faster, easier and cheaper. A scientific publication was produced from the data obtained in this part of the work and the plasmids were stored in the Addgene repository so that they are available to all users.

Keywords

Syntetická biologie, Viru podobné částice, Virové vektory, Virus mozaiky tabáku, Virus žluté zakrslosti fazolu

Keywords

Virus-like particles, Viral vectors, Tobacco mosaic virus, Bean yellow dwarf virus, Synthetic biology

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Pavel Ryšánek, CSc.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme / field:
Agricultural Specialization / Agricultural and Forestry Phytopathology and Plant Protection