Účinky xenobiotik na oxidační stres, metabolismus lipidů, integritu DNA a životaschopnost lidských buněk a rybího spermatu in vitro

Ing. Pavla LINHARTOVÁ

Doctoral thesis

Effects of xenobiotics on oxidative stress, lipid metabolism, DNA integrity and cell viability in human cells and fish spermatozoa in vitro

Abstract:

Znečišťování vodního prostředí anorganickými a organickými chemikáliemi je jedním z hlavních faktorů představujících vážnou hrozbu v přežití vodních organismů včetně ryb. Proto hodnocení rizik a přínosů týkajících se konzumace ryb je v současné době intenzivně diskutované téma veřejného zdraví. Spermie téměř všech druhů ryb se před oplodněním uvolňují do vodního prostředí, kde mohou být přímo vystaveny různým sloučeninám, jako jsou například cizorodé látky zahrnující též toxické kovy. Kromě toho i samotná expozice dospělých jedinců různým škodlivinám by mohla ovlivnit kvalitu rybích gamet, jejímž následkem bude snížená oplozovací schopnost a oplodnění samotné. Mimo jiné výhody konzumace ryb jsou dobře známé, a to nejen jako bohatého zdroje bílkovin a dalších nezbytných živin, ale rovněž i mnoha zdravotních výhod. Věda a výzkum v posledních několika desetiletích ukázaly, že živiny, zejména n-3 mastné kyseliny (MK), vyskytující se u ryb a mořských plodů, jsou prospěšné pro funkci srdce a nezbytné pro vývoj mozku. Celá práce byla založena na hodnocení dvou rozdílných typů modelových buněk. Za prvé lidské jaterní buňky (Hep G2, ATCC), které byly použity jako nástroj pro studium cytotoxicity kadmia (Cd2+) in vitro formou simulace po požití kontaminované ryby a následné změny ve složení mastných kyselin a fosfolipidových tříd. Za druhé byly pro studium účinků potenciálně nebezpečných xenobiotik vyskytujících se ve volných vodách použity jako in vitro model spermie jednoho ohroženého druhu ryby, jesetera malého (Acipenser ruthenus). Spermie jesetera malého byly vystaveny po dobu 2 hod při 4 °C koncentracím xenobiotik vyskytujících se v životním prostředí. Jmenovitě u DQ (0-150 µM), TBBPA (0-10 µg.L-1) a BPA (0-10 µg.L-1) byly analyzovány funkční parametry spermií (hybnost a rychlost), hodnocena míra poškození DNA (commet test), indexy oxidačního stresu (TBARS a CP), antioxidační odezvy (SOD aktivita) a v neposlední řadě i úbytek ATP. U Hep G2 buněk byla nejprve hledána vhodná netoxická koncentrace MK. U ošetřených buněk byl naměřen jak příjem MK tak i významně zvýšený podíl EPA a DHA v porovnání s kontrolní skupinou. Vzhledem k tomu, že dávky 25 µM DHA se ukázaly být pro buňky toxické, nižší koncentrace MK a to 5 µM EPA v kombinaci s 10 µM DHA (kde byl udržen poměr 1:2 MK, simulující obsah MK v rybím mase), byly stanoveny. Na metabolické úrovni, zvýšená koncentrace EPA a DHA po 24 hod. působení na buňky vedla ke zvýšení podílu kyseliny dokosapentaenové (DPA), což naznačilo jejich zvýšený metabolismus. Proto byly ověřeny i fosfolipidové třídy, kde se v důsledku přítomnosti 5 µM Cd2+ významně snížil cardiolipin (CL). Na hladině reaktivních částic kyslíku (ROS) nebyly evidovány významné změny mezi skupinami buněk vystavených MK (24 hod) a Cd2+ (24 hod), i když navýšená lipidová (TBARS) a proteinová (CP) oxidace byla zaznamenána u skupin buněk vystavených pouze dávkám Cd2+ (1 a 5 µM). Tyto výsledky naznačují, že pre-inkubace námi zvolenými MK významně snížily oxidační stres způsobený účinkem Cd2+. U rybího spermatu byla měřena rychlost spermií (µm/s) a procento pohyblivých spermií (%), které byly významně po jeho aktivaci sníženy v porovnání s kontrolou pro každé zvolené xenobiotikum. Míra poškození DNA vyjádřena jako % DNA v ocásku a Olive Tail moment byla vyšší, pokud byly spermie vystaveny koncentraci 2,5 µg.L-1 TBBPA nebo BPA a vyšším koncentracím těchto látek. Dále indexy oxidačního stresu, jako je oxidace lipidů (LO, měřena metodou TBARS), karbonylové deriváty proteinů (CP) a antioxidační aktivita (SOD), byly podstatně zvýšeny se stoup

Abstract:

Pollution of the aquatic environment by inorganic and organic chemicals is a major factor posing a serious threat to the survival of aquatic organisms including fish. In addition balancing risks and benefits of fish consumption is nowadays an intensively discussed public health topic. Spermatozoa of almost all fish species are released into water environment where they can be directly exposed to various compounds, such as xenobiotics including toxic metals, prior to fertilization. In addition, exposure of parental adults to various xenobiotics may affect gamete quality, which may subsequently reduce fertilization success. On the other hand the advantages of eating fish are well-known, not only in the point that fish is a healthy source of protein and other nutrients, but eating contaminated fish may also confer various health benefits. Research over the past few decades has shown that the nutrients and particularly the n-3 fatty acids (FA) found in fish and seafood, are for examples protective against cardiac diseases and have a positive impact on brain development. The thesis provides a focus on two different cell model types. Firstly, human hepatocellular cells (Hep G2, ATCC) were used as in vitro tool for studying the effect of the intake of cadmium (Cd2+) contaminated fish on cytotoxicity, oxidative stress and fatty acid and phospholipid class compositions. Secondly, spermatozoa of one threatened species of fish, sterlet (Acipenser ruthenus) were used as in vitro model for studying effect of potentially hazardous xenobiotic compounds' occurring in open waters. Sperm from sterlet were exposed for 2h to environmentally relevant concentrations of DQ (0-150 µM),TBBPA (0-10 µg.L-1), and BPA (0-10 µg.L-1) at 4 °C. Sperm functional parameters (motility and velocity), assesment of DNA damage (commet assay), oxidative stress indices (TBARS and CP), antioxidant response (SOD activity) and ATP content were analyzed. In Hep G2 cells we first established the appropriate non-toxic FA concentration. A significant increased proportion of EPA and DHA in the treated cells compared to the control group with confirming the uptake, were measured. Since doses of 25 µM DHA showed to be toxic to the cells, lower FA concentrations: 5 µM EPA in combination with 10 µM DHA (to keep ratio 1:2 of FA to simulate fish FA content) were settled. On the metabolic level, increased concentrations of 24h EPA and DHA combined incubation resulted in an increased proportion of docosapentaenoic acid (DPA) indicating an increased metabolism. In addition, incubation with 5 µM Cd2+ for 24h decreased the total cardiolipin (CL) fraction from the identified phospholipids. We did not find any significant changes in ROS levels for group of cells exposed to FA (24h) and Cd2+ (24h), whereas increased lipid (TBARS) and protein (CP) oxidation levels were indicated in the cells exposed to only Cd2+ (1 and 5 µM). These results indicate that the pre-incubation with the chosen FA significantly reduced the oxidative stress caused by the Cd2+. Regarding fish sperm the measured spermatozoa velocity (µm/s) and percentage of motile spermatozoa (%) were significantly decreased at each time post-activation in comparison with control for each xenobiotic. The level of DNA damage expressed as % DNA in Tail and Olive Tail moment increased when spermatozoa were exposed to a concentration of 2.5 µg.L-1 of TBBPA and BPA and above. The level of oxidative stress indices such as lipid oxidation (LO, measured by TBARS method), carbonyl derivatives of proteins (CP) and antioxidant activity (SOD) increased significantly with increased concentrations of DQ, TBBPA and BPA. The obtained data in present thesis gave us new insights into the effects of fish nutrients and xenobiotics on cell metabolism at different levels with a focus on changes in lipid classes and oxidative stress.

Abstract:

ající koncentrací DQ, TBBPA a BPA. Získané výsledky propojující tuto práci nám daly nový pohled na účinky živin ryb a mechanismy působení xenobiotik ovlivňujících metabolismus buněk z hlediska zaměření na změny v jejich lipidových třídách a spojené s výskytem problematického oxidačního stresu.

Keywords

Lidské buňky, rybí sperma, mastné kyseliny, xenobiotika, těžký kov, oxidační stres, DNA integrita, životaschpnost buněk.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 9. 2016

Thesis defence

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery