Elektrochemická analýza nukleových kyselin a bílkovin pro biomedicínu

Mgr. Martin Bartošík, Ph.D.

Doctoral thesis

Electrochemical analysis of nucleic acids and proteins for biomedicine

Anotácia:

Pro bližší pochopení struktury, funkce nebo interakcí nukleových kyselin a bílkovin je v dnešní době užíváno velké množství analytických metod, přičemž mnohé z nich jsou běžně aplikovány i v biomedicíně pro diagnostické účely. Elektrochemie by mohla představovat zajímavou alternativu k těmto robustním metodám, protože nabízí jednodušší a levnější přístrojové vybavení, kratší doby analýz a schopnost miniaturizace a paralelní analýzy více vzorků. Současný výzkum se proto snaží o eliminaci hlavních nevýhod spojených s analýzou těchto biomakromolekul, a o zlepšení citlivosti a selektivity elektrochemických měření. Disertace je rozdělena do několika částí, při čemž každá z nich se zabývá poněkud rozdílnými dílčími tématy. Nicméně všechny mají určité společné charakteristiky. První část vymezuje důvody, proč byla zvolena elektrochemie, krátce vysvětluje principy elektrochemických technik a stručně popisuje její historii a aplikace v analýze nukleových kyselin a bílkovin. Další část představuje experimentální výsledky získané v naší laboratoři během posledních několika let. Je například popsána analýza chromosomální DNA voltametrií pravoúhlým napětím (SWV), založená výhradně na redukčních signálech cytosinových a adeninových zbytků na rtuťových elektrodách (bez potřeby použít značení). Zde se ukazuje, že změnou frekvence SWV pulsů lze stanovit nižší koncentrace DNA. V jiné práci jsme se dotkli populární oblasti elektrochemických senzorů pro hybridizaci DNA, a to konstrukcí vysoce citlivého genosenzoru schopného detekovat pikomolární koncentrace bakteriálních nukleových kyselin v neupravovaném a neředěném lidském krevním séru nebo moči bez amplifikace PCR. Také jsme aplikovali elektroaktivní značku, a to komplex šestimocného osmia s dusíkatým ligandem, pro citlivé stanovení oligonukleotidů obsahujících ribózu, což lze v principu rozšířit i pro reálné vzorky RNA, včetně mikroRNA. Posléze jsme obrátili pozornost k proteinům, speciálně k jejich schopnosti poskytovat elektrokatalytický signál (pík H) na rtuťových elektrodách vzhledem k přítomnosti aminokyselin obsahujících labilní protony. Tato jejich schopnost byla využita při studiu interakcí bílkovin (riboflavin-vazební protein) s nízkomolekulárními sloučeninami (riboflavin), ve které bylo ukázáno, že vazba sloučeniny na bílkovinu vede ke změně elektrokatalytického píku H poskytovaného touto bílkovinou, a to zejména díky konformačním změnám proteinu vyvolaným vazbou nízkomolekulární látky.

Abstract:

Until now, a huge variety of analytical techniques were employed to better understand structure, functions and interactions of both nucleic acids and proteins, and many of them are routinely applied in biomedicine for diagnostics reasons. Electrochemistry could represent an interesting alternative for these robust methods, because it offers simpler and cheaper instrumentation, shorter analysis times and capability for miniaturization and parallel analysis of multiple samples. Current research is thus aiming to eliminate major drawbacks associated with the analysis of these biomacromolecules and to improve sensitivity and selectivity of electroanalytical assays. This dissertation is divided into several parts, each of them dealing with little bit different subtopic. Nevertheless, all of them share common characteristics. First part outlines reasons for choosing electrochemistry and gives a brief explanation of electrochemical techniques, along with a short history and overview of their application in nucleic acids and proteins analysis. Next part briefly introduces experimental results obtained in our lab within last few years. For instance, square wave voltammetric (SWV) analysis of chromosomal DNA is described, relying solely on intrinsic reduction signals from cytosine and adenine residues at mercury-based electrodes (i.e., without a need for labeling) and showing that by changing the frequency of the SWV pulses, lower DNA concentrations could be determined. In different work, we have “touched” a popular field of electrochemical DNA hybridization sensors by constructing highly sensitive genosensor, capable of detecting picomolar concentrations of bacterial nucleic acid in untreated and undiluted human serum and urine without PCR amplification. We have also applied electroactive label, complex of six-valent osmium with nitrogenous ligand, for sensitive determination of ribose-containing oligonucleotides, expandable, in principle, for real RNA samples, including microRNAs. Then the attention is turned to the field of proteins, especially to their ability to produce electrocatalytic signals (peak H) at mercury electrodes. This ability was utilized in a study of protein interaction (riboflavin-binding protein) with a low molecular-weight compound (riboflavin), in which it was shown that binding of the compound by the protein leads to a change of the electrocatalytic peak H produced by this protein, mainly due to conformational changes induced by the binding.

Keywords

nukleová kyselina, bílkovina, elektrochemie, hybridizace DNA, elektrokatalýza nucleic acid, protein, electrochemistry, DNA hybridization, electrocatalysis

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 4. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 11. 6. 2012
• Vedúci: prof. RNDr. Emil Paleček, DrSc.
• Oponent: prof. RNDr. Libuše Trnková, CSc., Dr. Michael Heyrovský, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Physics (4-years) / Biophysics