Studium funkce T-lymfocytů u prasat s dědičným melanomem.

Barbora Šedivá

Master's thesis

Study of T-lymphocyte function in pigs with hereditary melanoma.

Abstract:

Maligní melanom kůže vzniká neoplastickou proliferací kožních melanocytů. Jedná se o nádor s nejrychleji vzrůstajícím se výskytem na světě. U některých lidských nádorových antigenů byly zjištěny specifické T buněčné odpovědi. Pro studium faktorů zodpovědných za rozvoj nádorů a pro hledání nových, více efektivních terapeutických technik, je velmi důležité využívání zvířecích modelů. Prasečí melanom je v biochemických, imunohistochemických a molekulárně biologických vlastnostech velmi podobný lidským maligním melanomům. Prasata MeLiM (Melanoma bearing Libechov Minipig) mají schopnost spontánní regrese melanomu, jejíž mechanizmus není dosud známý. Předběžné výsledky ukazují zvýšené množství proteinů teplotního šoku a následné zvýšení infiltrace tumoru T lymfocyty. U rychle rostoucích nádorů nastává spontánní regrese ve věku tří až čtyř měsíců, u pomalu rostoucích nádorů ve věku pěti až sedmi měsíců. Byla stanovena hypotéza, že regrese melanocytů je spojena s aktivací T lymfocytů, která se po stimulaci nádorovým antigenem projeví zvýšenou proliferací a produkcí cytokinů. Cílem práce bylo zavést metody pro detekci specifické imunitní odpovědi v periferní krvi u prasat s melanomem a ověřit hypotézu. Pro vykonané experimenty byla prasatům různého stáří odebrána periferní krev z vena jugularis. Pro vyhodnocení exprese cytokinů a měření podílu proliferujících CD4+ T lymfocytů byla prasata rozdělena do tří skupin: na čtyřtýdenní, devítitýdenní a šestnáctitýdenní. Jako kontroly, byla použita stejně stará zdravá bílá prasata. První zaváděnou metodou bylo intracelulární barvení IFN gamma. U této metody jsem si pouze ověřili, že jsme schopni intracelulární IFN gamma označit a detekovat ho. Následovalo stanovení exprese vybraných cytokinů, měřených po stimulaci mononukleárních buněk PMA a ionomycinem. Zjistili jsme, že rozdíl mezi čtyř a devítitýdenními prasaty není statisticky významný. U šestnáctitýdenních prasat byl pozorován výrazný pokles relativní exprese většiny cytokinů. Poslední metodou bylo měření proliferační aktivity u CD4+ T lymfocytů. Po stimulaci mononukleárních buněk lyzátem z melanomu, byly objeveny rozdíly v proliferaci buněk ve fázi spontánní regrese nádorů. Z výsledků je patrné, že nárůst proliferujících buněk u devítitýdenních prasat koreluje s již nastartovanou imunitní odpovědí proti melanomům. Podobně, jako u měření exprese cytokinů, bylo procento proliferujících buněk u šestnáctitýdenních prasat výrazně sníženo. Vzhledem k tomu, že u nejstarších prasat došlo k poklesu proliferace a exprese cytokinů, byla hypotéza potvrzena jen částečně. Výsledky by bylo dobré ověřit v dalších experimentech, pro jejichž zopakování se jako nejvhodnější metody jeví barvení intracelulárního IFN gamma a měření proliferační aktivity CD4+ T lymfocytů. Zajištění dat o rozvoji imunitní odpovědi v čase, by mohlo pomoci při objasňování mechanismu spontánní regrese u prasat a k dalšímu využití v protinádorové léčbě u lidí.

Abstract:

Malignant skin melanoma is developed by neoplastic proliferation of skin melanocytes. This tumor has the highest raising rate of occurrence in the world. There have been some specific T-cells answers of human tumor antigens detected. The animal models are very important for research of factors responsible for tumor development and searching for new and more effective therapy techniques. The pig melanoma is in biochemical, immunohistochemical and molecular ways very similar to the human one. The MeLiM pigs (Melanoma bearing Libechov Minipig) have the ability of spontaneous melanoma regression. Its mechanism is not known yet. Preliminary outcomes show higher amount of thermal shock protein following by higher T lymphocytes tumor infiltration. The regression comes at age of three to four months in case of fast growing tumor, in case of slowly growing one at age of five to seven months. There was a hypothesis determined, that regression of melanocytes is connected to T lymphocytes activation that shows higher proliferation and cytokines production after tumor antigen stimulation. The goal of this diploma thesis was to implement methods for detection of specific immune answers in peripheral blood of pigs with melanoma and to verify this hypothesis. For executed experiments the peripheral blood from vena jugularis of pigs of different age was removed. For evaluation of cytokines expression and proliferating CD4+ T lymphocytes share measurement, the pigs were divided to three groups by the ages: four weeks old, nine weeks old and sixteen weeks old. The same old healthy white pigs were used as check. The first implemented method was intracellular staining by IFN gamma. With this method, we only confirm that we are able to identify and detect intracellular IFN gamma. The next step was chosen cytokines expression assessment measured after PMA and ionomycin mononuclear stimulation. The difference between four and nine weeks old pigs is statistically insignificant. The significant decrease of expressed cytokines by sixteen weeks old pigs was observed. The last method was proliferous activity of CD4+ T lymphocyte measurement. After stimulation of mononuclear cells by melanoma lysate, the differences in cells proliferation in spontaneous tumor regression were discovered. There is evident that increase of proliferating cells by nine weeks old pigs correlates with already started immune answer against melanomas. The percentage of proliferating cells at the group of sixteen weeks old pigs was distinctly reduced, similarly to cytokines expression measurement. Due to decrease of proliferation and expression at the group of the oldest pigs, the hypothesis was confirmed only partially. These outcomes are recommended to verify in other experiments. The most appropriate methods for the repetition are intracellular IFN gamma staining and measuring the proliferation activity of CD4+ T lymphocytes. The real -- time immunologic answer data detection could help with pig's spontaneous regression mechanism clarification and further usage in antitumor treatment.

Keywords

prase, melanom, regrese melanocytu, T-lymfocyt, cytokiny

Keywords

T lymphocyte, pig, melanoma, melanoma regression, cytokines

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 4. 2015

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Mgr. Markéta Sedmíková, Ph.D.
• Reader: Petra Kučerová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction