Role of lithocholic acid-induced cell signalling in oesophageal cancer progression model

Ashita Singh, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Chronický zánět hraje zásadní roli při vzniku adenokarcinomu jícnu (OAC) a jeho prekurzorové léze, Barrettova jícnu (BE). Barrettova metaplazie vzniká jako adaptace na patologické intraezofageální prostředí u chronické gastroezofageální refluxní choroby. Reflux žlučových kyselin byl identifikován jako zásadní environmentální faktor zvyšující riziko výskytu OAC, není však jasné, jak reflux souvisí se známými genetickými kontrolními body progrese tohoto nádoru. U OAC byla pozorována vysoká frekvence mutací v genu p53, které zpravidla vznikají během vývoje nádoru z dysplazie nízkého stupně směrem k dysplazii vysokého stupně (HGD). Není však jasné, zda mutace v p53 ovlivňují přežívání buněk při recidivujícím poškození žlučovými kyselinami. Výsledky uvedené v této práci ukazují, že inaktivace genu p53 v buňkách Barrettova jícnu (linie CP-A) nenavozuje rezistenci, ale naopak zvýšenou citlivost vůči buněčné smrti indukované kyselinou lithocholovou (LCA). To naznačuje, že samotná inaktivace p53 neposkytuje výhody pro přežití při poškození žlučovými kyselinami. Pozorovali jsme však, že tato změna vede k narušení mitochondriálních funkcí. Provedli jsme proteomický screening s využitím buněk s funkční a inaktivovanou variantou genu p53 za účelem identifikace efektorových genů LCA, které mohou poskytovat růstovou výhodu a vytvářet tlak na selekci mutací. Podařilo se nám tak identifikovat nové geny indukované LCA včetně SMAD4 a TGFBI, které hrají oba roli v signální dráze TGF$\upbeta$. V této souvislosti je zajímavé, že u pacientů s OAC se vyskytuje mutace v genu SMAD4 s vysokou četností a je považována za změnu, která vymezuje hranici mezi dysplazií vysokého stupně a OAC. Na základě tohoto zjištění jsme vytvořili klinicky relevantní buněčný model s vyřazenou funkcí dvou genů, p53 a SMAD4, u kterého jsme pozorovali rezistenci vůči apoptóze indukované LCA. Dále jsme ukázali, že ztráta SMAD4 vede v buňkách k navození změn typických pro pokročilá stádia rakoviny a také k celkově zvýšené hladině proteinů regulujících buněčné procesy související s cholesterolem. Z toho vyplývá, že SMAD4 je negativním regulátorem homeostázy cholesterolu. Naše zjištění naznačují, že současná ztráta SMAD4 a p53, spíše než jen samotného p53, poskytuje buňkám výhodu pro přežití při opakovaném poškození žlučovými kyselinami během vývoje OAC. Tato práce tak přispívá k objasnění souvislostí mezi faktory prostředí a genetickými změnami u OAC a naše poznatky mohou být relevantní i pro další typy karcinomů, na jejichž vzniku se podílí působení žlučových kyselin. Objevili jsme také nové signalizační komplexy indukované interferonem v buněčné linii odvozené z OAC (Flo-1), k čemuž jsme využili námi vyvinutou metodu hmotnostně-spektrometrické detekce zesíťovaných proteinů (CLMS). Identifikovali jsme proteiny H2B a MDN1 jako nové interakční partnery HLA-A a předpokládáme, že metoda CLMS by mohla najít širší uplatnění při studiu dynamiky proteinových interakcí v mikroprostředí nádoru.

Abstract:

Chronic inflammation due to relux gastric fluid is crucial in the development of oesophageal adenocarcinoma (OAC) and its precursor lesion - Barrett’s oesophagus (BE). Barrett’s metaplasia illustrates a successful adaptation to the harsh intraesophageal environment of chronic gastroesophageal reflux disease. Environmental pressures that impact on OAC incidence have been linked to bile acid reflux, however, how reflux relates to commonly known genetic checkpoints in OAC is unclear. A high frequency of genetic alterations in the p53 gene is observed during OAC progression from low to high-grade dysplasia (HGD). Whether mutations in p53 at this checkpoint provide survival advantages against recurrent bile acid injury remains elusive. In this study, a genetically engineered p53 gene inactivation in the CP-A Barrett’s cell model exhibited enhanced sensitivity, rather than resistance, to lithocholic acid (LCA)-induced cell death. This suggests that p53 inactivation alone does not provide survival advantages against bile acid injury, but instead was found to perturb mitochondrial functionality. To identify potential LCA effector genes that provide growth advantage and favour genetic mutation selection, we carried out a proteome screen using wild type and p53 knockout cells. We identified novel LCA-induced TGFβ pathway targets including SMAD4 and TGFBI. Interestingly, SMAD4 is known to demarcate a genetic boundary between HGD and adenocarcinoma, and is deleted at a relatively high frequency in OAC patients. As such we engineered a clinically relevant p53-SMAD4 double-null cell model which exhibits resistance to LCA-induced apoptosis. Loss of SMAD4 leads to the enrichment of several gene signatures relevant to cancer progression and enhanced cholesterol homeostasis, implicating SMAD4 as a negative regulator of cholesterol homeostasis. Together, these data suggest that concomitant loss of SMAD4 and p53, rather than p53 alone, during the course of OAC progression provides a survival advantage when exposed to recurrent bile acid injury. Our findings also highlight a novel link between environment factors and genetic mutations in the progression of OAC, and allude to similar links in other bile-related carcinomas. In addition to bile acid reflux which forms a significant environmental landscape, innate immune system via interferon signalling also needs to be integrated into cell models. As such, we showcased a proof-of-principle cross-linking mass spectrometry (CLMS) study to identify novel interferon-induced signalling complexes in a highly immune-responsive OAC cell line, Flo-1. We identified H2B and MDN1 as novel interacting partners of HLA-A, and anticipate broader use of CLMS to identify novel protein interaction dynamics within the tumour microenvironment.

Keywords

Oesophageal adenocarcinoma, Barrett’s oesophagus, Bile acids, Lithocholic acid, SMAD4, Cross-linking mass spectrometry Adenokarcinom jícnu, Barrettův jícen, žlučové kyseliny, Lithocholová kyselina, Hmotnostní spektrometrie zesíťovaných proteinů

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 3. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 14. 4. 2023
• Supervisor: RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc.
• Reader: doc. Mgr. Jan Bouchal, Ph.D., prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Molecular and Cell Biology and Genetics / Molecular and Cell Biology and Genetics