Molekulární markery mutací genu FGF5 zodpovědných za dlouhou srst u plemene československý vlčák a možnosti jejich aplikace v plemenitbě

Bc. Klára Krausová

Diplomová práce

Molecular markers of FGF5 gene mutations responsible for long hair in the Czechoslovakian Wolfdog breed and their application in breeding

Anotace:

V diplomové práci byla řešena problematika kauzálních mutací genu Fgf5, které ovlivňují délku srsti u modelové populace československých vlčákůGen Fgf5 má tři dobře zmapované exony a velmi dlouhé sekvence intronů. U Canidae je lokalizován na chromozomu 32. Gen Fgf5 je exprimován v podobě proteinu FGF5, jehož funkcí je regulace růstu chlupového folikulu a vlasového vlákna. Mutací v genu Fgf5 dochází ke změně pořadí aminokyselin, a tím konformační změně proteinu FGF5, který tak ztrácí svou funkci, následkem čehož dochází k nadměrnému růstu vlasových vláken. Gen Fgf5, společně s kauzálními mutacemi, které mají za následek efekt prodlužování délky vlasového vlákna, byl popsán u mnoha živočišných druhů.Plemeno československý vlčák má standardně krátkou srst, a mutace genu Fgf5 má za následek nestandardní dlouhou srst. V posledních letech se v populaci československého vlčáka rodí více štěňat s dlouhou srstí než v minulosti. Z těchto důvodů bylo plemeno označeno jako vhodná modelová populace pro detekci kauzálních mutací v genu Fgf5. Československý vlčák je mladé plemeno, u kterého je podrobně zpracována rodokmenová databáze. V této databázi je možno dohledat rodokmeny jednotlivých linií až k původnímu křížení karpatského vlka s německými ovčáky, o kterých se předpokládá, že byli potencionálními nosiči mutace. Tento předpoklad byl ověřován vyloučením mutace genu Fgf5 jako mutace de novo. Pro analýzu bylo použito 185 fen a 198 psů plemene československý vlčák, ve věku 1-251 měsíců, z různých zemí. Pro analýzu byla využita genomická DNA z buněk bukálních sliznic. Na základě známé genomické sekvence Canis lupus familiaris byly navrženy dva molekulární markery umožňující detekci substituční mutace FGF5:c.284G˃T a indelové mutace FGF5:c.145_150dupACCAGC. Byla potvrzena kauzalita obou mutací. Bylo prokázáno, že českoslovenští vlčáci nesoucí substitučně mutovanou alelu současně nenesou 6 bp duplikaci v exonu 1 genu Fgf5.Výsledky genotypizace byly zpracovány z hlediska populační genetiky. Byla stanovená pozorovaná a očekávaná heterozygotnost. Koeficient inbreedingu z pohledu mutací genu Fgf5 byl stanoven jako velice nízký. Z dat molekulární a populační analýzy byla stanovena prognóza vývoje frekvence mutované alely v populaci. V případě úplné selekce vůči recesivním homozygotům se má dle této prognózy frekvence mutované alely snižovat. Pro pokles frekvence mutované alely na 1 % bude zapotřebí alespoň 83 generací úplné selekce. Poměr výskytu mutované a nemutované alely byl statisticky hodnocen pomocí χ2 testu, s cílem odhalit vliv stáří, pohlaví a původu hodnocených zvířat na segregaci těchto alel. Tato statistická analýza odhalila, že na hladině významnosti α=0,05 existují rozdíly v poměru mutované a nemutované alely mezi vytvořenou kategorií českých a slovenských psů a kategorií psů pocházejících z ostatních zemí. Získaná molekulární data byla porovnána s genealogickými záznamy v mezinárodní databázi plemene československý vlčák. Na základě srovnávací analýzy byla potvrzena hypotéza, že s vysokou pravděpodobností je donorem mutované alely genu Fgf5 jediný zástupce plemene německý ovčák (Bojar vom Schoterrhorf), který se podílel na vzniku plemene.

Abstract:

The issue of causal mutation in gene Fgf5, which affect the length of coat in model population of the Czechoslovakian Wolfdog, was studied in this diploma thesis.Gene Fgf5 has three well mapped exons and long sequences of introns. In the Canidae family is this gene located on chromosome 32. Gene Fgf5 is expressed in the form of protein FGF5, which has regulation effect on the hair follicle and hair strand development. Mutation in gene Fgf5 leads to change of amino acids, which leads to change of protein conformation and loss of his regulation function, and the hairs uncontrollably grow. Gene Fgf5, along with casual mutations leading to prolonging the hair strand, was observed and described among many species.The Czechoslovakian Wolfdog breed has standard short hair and the mutation in gene Fgf5 leads to nonstandard long hair. More long-haired dogs were born in the population of the Czechoslovakian Wolfdog in past few years. According to those facts was this breed pointed as suitable model population for the gene Fgf5 causal mutation detection. The Czechoslovakian Wolfdog is a young breed with well sustained genealogy database. In this database is possible to find the bloodline of specific dog ancestries up to the original breeding of the Carpathian wolf and the German Shepherd. The German Shepherd is considered as potential bearer of the mutation. This assumption was verified by eliminating the de novo status of the mutation. 185 females and 198 males of the Czechoslovakian Wolfdog in age 1-251 months from different countries was used for the analysis.For the molecular analysis genomic DNA, obtained from buccal mucous membrane cells, was used. Molecular markers for detecting the substitute mutation FGF5:c.284G˃T and the indel mutation FGF5:c.145_150dupACCAGC were designed based on knowledge of gene sequence in Canis lupus familiaris. The causality of both mutations was confirmed. It was also confirmed, that the Czechoslovakian Wolfdog is bearer of those mutation, moreover the bearer of allele with substitute mutation lack the 6 bp duplication in exon 1 of gene Fgf5. The results of genotyping were observed from the population genetics view. The observed and expected heterozygosity was set, along with the coefficient of inbreeding which was calculated as low for the Fgf5 mutation. Prognosis of the mutated allele frequency development was set from the molecular and population data. According to this prognosis the frequency of mutated allele will decrease in the presence of strong selection against recessive homozygotes. For decrease of the mutated allele frequency on 1 % would be needed 83 generations of strong selection. The ratio of mutated and non-mutated allele occurrence was statistically evaluated by the χ2 test, to detect the influence of age, gender and country of origin on the allele segregation. This statistic analysis, with significance level α=0,05, proved existence of mutated and non-mutated allele ratio differences between adjusted category of Czech and Slovakian gods and the category of dogs from other countries.Obtained molecular data were compared to the genealogy records from international databases of the Czechoslovakian Wolfdog. The hypothesis of only one potential ancestral bearer of the Fgf5 mutated allele was confirmed by the comparative analysis. The anticipated German Shepherd (Bojar vom Shcoterrhorf) participated on the origin of the Czechoslovakian Wolfdog breed.

Klíčová slova

československý vlčák, délka srsti, FGF5, fibroblastový růstový faktor 5, genotypizace, Canis lupus familiaris

Keywords

Canis lupus familiaris, Czechoslovakian Wolfdog, hair length, FGF5, fibroblast growth factor 5, genotyping

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 4. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie