Konstrukce molekulárních nástrojů pro objevování a modulaci rostlinných hormonálních systémů

Bc. Dušan Turek

Diplomová práce

Designing molecular tools for the discovery and modulation of plant hormone systems

Anotace:

Život rostliny je omezen na jednu lokalitu. Její vývoj a růst je ovlivňován vnějšími faktory, jakými jsou počasí nebo kvalita půdy. Rostlina dokáže částečně kompenzovat vlivy z vnějšího prostředí tak, že mění hladinu aktivních rostlinných hormonů, čímž dojde ke změně fyziologických parametrů v těle rostliny. Množství fytohormonů je dynamicky řízeno řadou komplexních procesů, kdy se všechny dílčí kroky (počínaje biosyntézou přes aktivací konče degradací fytohormonu) neobejdou bez přítomnosti rostlinných enzymů. Tato práce se zabývá studiem konkrétního enzymu, a to kukuřičné β-glukosidasy Zm-p60.1. Zm-p60.1 je enzym, který se účastní metabolismu cytokininů a dokáže přeměnit neaktivní glykosylovanou formu cytokininu na jeho aktivní formu. Zm-p60.1 je tedy jedním z prvků, který reguluje hladinu aktivních hormonů. Změněná aktivita nebo specificita tohoto enzymu poskytuje nástroj, jímž by bylo možné jemně modulovat hladinu cytokininů v rostlině a tím ovlivňovat jednotlivé procesy, jakými jsou například buněčné dělení, diferenciace kořenů, růst pupenů a jiné další procesy. Proteinové inženýrství nabízí prostředky ke změně substrátové specificity tohoto enzymu. Substrátová specificita enzymu Zm-p60.1 je určena složením aminokyselin v okolí aktivního centra. Pozice W373 v Zm-p60.1 se podílí na stacking interakci s aromatickým systémem na substrátu. Strukturním přeložením 33 glykosidhydrolas (GH) z rodiny GH1 bylo zjištěno, že pozice W373 je strukturně fixovaná. Stejně tak z mnohonásobného sekvenčního srovnání charakterizovaných enzymů taktéž z rodiny GH1, bylo zjištěno, že W373 je sekvenčně značně zachovalý, přesto se vyskytují na této pozici i jiné aminokyseliny. Saturační mutagenezí byla vytvořena knihovna 20-ti mutantů na pozici W373. Na umělých substrátech byl proveden předběžný test sledující vliv mutací na aktivitu mutantních enzymů. Nejvyšší aktivitu ze všech mutantů vykázala původní divoká forma enzymu Zm-p60.1 (W373). Jako druhým nejaktivnějším se jeví W373H. Za ním, ale s výrazně menší aktivitou, je skupina 4 mutantů W373F, W373G, W373T a W373Y. Ostatní mutanti měli velmi malou nebo žádnou aktivitu. Nové funkční varianty β-glukosidasy Zm-p60.1 budou dále studovány pro stanovení změny substrátové specificity vůči konjugátům cytokininů. Pokud bude taková změna nalezena, mohly by nové glukosidasy sloužit jako nástroj pro studium hormonálního systému rostlin.

Abstract:

Plant life is limited to one location. Their development and growth is influenced by external factors such as weather or soil quality. Plant can partially compensate effects of the external environment by changing the level of active plant hormones resulting to the change čímž of physiological parameters in their body. The amount of phytohormones is dynamically directed by a series of complex processes, in which all sub-steps (starting from biosynthesis continuing with the activation of phytohormones and ending with degradation) can not do without the presence of plant enzymes. This work deals with the study of a particular enzyme, β-glucosidase Zm-p60.1 coming from corn. Zm-p60.1 is an enzyme that is part of cytokinin metabolism and can convert the inactive glycosylated form of cytokinin to its active form. Zm-p60.1 is one component that regulates the level of active hormones. Altered activity or specificity of this enzyme provides a tool which would be possible to use for fine modulation of the cytokinin level in the plant and thereby affect individual processes such as cell division, differentiation, root growth, sprout growth and other processes. Protein engineering offers a means to change substrate specificity of this enzyme. Substrate specificity of the enzyme Zm-p60.1 is determined by amino acid composition in the vicinity of active center. The W373position in Zm-p60.1 is involved in stacking interaction with aromatic system on the substrate. By structural folding of 33 glycosidases from GH1 family was found that the position of W373 is highly preserved. Likewise, by the multiple sequence comparison of characterized enzymes from GH1 family, it was found that the W373 is sequentially preserved with a few exceptions where in this position occur other amino acids. By saturation mutagenesis was created a library containing 20-mutants at position W373. On artificial substrates was carried out preliminary test studying the effects of mutations on the activity of mutant enzymes. None of the mutants had higher activity than the original wild enzyme form of Zm-p60.1 (W373W). As the second most active appears W373H followed by group of 4 mutants W373F, W373G, W373T and W373Y with significantly lower activity. Other mutants had little or no activity. New variants of functional β-glucosidase Zm-p60.1 will be further studied to determine changes in substrate specificity towards cytokinin conjugates. If such a change will be found, a new glucosidases could serve as a tool for studying the hormonal system of plants.

Klíčová slova

beta-glucosidase, CAZy, GH1, combinatoric mutagenesis, transformation, beta-glukosidasa, kombinatorická mutageneze, transformace

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 5. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 21. 6. 2012
• Vedoucí: Mgr. Pavel Mazura, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Fyzika / Biofyzika