Charakterizace proteinů polyvalentního stafylokokového bakteriofága podílejících se na lyzi hostitelské buňky

Mgr. Martin Benešík, Ph.D.

Doctoral thesis

Characterization of proteins from polyvalent Staphylococcal bacteriophage which are involved in lytic process of host cell

Anotácia:

Přirozené mutanty s širokým rozmezím hostitele odvozené od fága 812, který patří do čeledi Myoviridae a rodu Kayvirus jsou vhodné pro použití ve fágové terapii stafylokokových infekcí. Bezpečné zavádění fágových přípravků do medicíny, biotechnologií nebo potravinářského průmyslu vyžaduje důkladnou charakterizaci těchto fágů, ale také jejich lytických enzymů, které mají řadu praktických aplikací. Cílem této práce bylo charakterizovat fágové lytické enzymy, které se v lytickém cyklu fága uplatňují při vytváření póru v buněčné stěně pro průchod DNA do bakterie a jsou strukturní součástí virionu fága, ale také endolyziny, které zajišťuji uvolnění zralých fágových virionů z bakterie na závěr lytického cyklu. Studovaný endolyzin mutanty v rozmezí hostitele fága 812F1, označený LysF1, je přirozenou deleční mutantou endolyzinu LysK. Tato deleční varianta nebyla dosud testována z hlediska antimikrobiální aktivity. V práci jsou charakterizovány dvě proteinové domény LysF1, jak katalytická štěpící peptidoglykan, tak SH3b vazebná doména (CBD), která zprostředkovává interakci s buněčnou stěnou. Lytické spektrum endolyzinu LysF1 bylo stanoveno na 43 druzích rodu Staphylococcus a na vybraných druzích byla určena jeho specifická aktivita. CBD, která je součástí LysF1, pozitivně ovlivňuje jeho lytickou aktivitu. Výsledky vazebných testů ukázaly, že CBD je schopná vázat se na všechny 3 typy peptidoglykanu vyskytujícího se u stafylokoků, které se liší peptidickým můstkem, ale také na peptidoglykan Streptococcus uberis. Schopnost CBD vázat se i na živé buňky byla ověřena in vivo pomocí fluorescenční mikroskopie s SH3b doménou fúzovanou s GFP. Metodou NMR byla stanovena struktura CBD. LysF1 byl testován také pro praktické aplikace, kdy byl použitý pro izolaci DNA ze stafylokoků, a bylo definováno složení lyofilizované lékové formy, v které by se enzym zachoval stabilní. V rámci této práce byla na virionu fága 812 identifikována bičíková hydroláza TmpD a byla potvrzena lytická aktivita její CHAP domény. Doména byla připravena jako rekombinantní protein a purifikována pro účely strukturní studie, díky které byla determinována 3D struktura. Bičíková hydroláza byla lokalizována ve struktuře bakteriofága získané rekonstrukcí kryoelektronovou mikroskopií. Široké lytické spektrum LysF1 a jeho vysoká aktivita z něj činí vhodného kandidáta pro praktické použití jako antimikrobiální agens. Také výsledky izolace DNA srovnatelné s lyzostafinem a dobrá stabilita v lyofilizovaných tabletách potvrzuje tyto pozitivní předpoklady. U CBD nebyla prokázána rodová specifita, proto je na zvážení její použití jako diagnostického nástroje. Ovšem široké spektrum její vazby na různé peptidoglykany ji činí vhodnou pro kombinaci s katalytickými doménami k vytváření nových chimérických lyzinů s vyšší aktivitou.

Abstract:

The spontaneous broad host-range mutants derived from phage 812 from Myoviridae family and Kayvirus genus, are suitable for use in phage therapy of staphylococcal infections. Safe implementation of phage prpeaprations in medicine, biotechnology and food industry need careful characterization of these phages and their lytic enzymes, which have various practical uses.The aim of this study was to characterize phage lytic enzymes, which role in the lytic cycle of the phage is to create a pore in the cell wall for DNA transfer into the bacterial cell and which are a structural compound of the phage particle, but also endolysins, which enable mature phage particles to leave the bacterium at the end of the lytic cycle. The studied endolysin of the broad host-range mutant of phage 812F1, designated LysF1, is a natural deletion mutant of LysK endolysin. This deletion mutant was not so far tested for its antimicrobial activity. In this study two protein domains of LysF1 are characterized, the catalytic domain which cleaves peptidoglycan and SH3b binding domain (CBD) which enables interaction with the cell wall. The lytic spectrum of LysF1 endolysin was determined on 43 staphylococcal species and selected species were used for testing its specific activity. CBD being a part of LysF1 positively influences its lytic activity. Results of binding tests show that CBD is able to bind to all three types of peptidoglycan found in staphylococci, which differ in interpeptide bridge, but also to peptidoglycan of Streptococcus uberis. The ability of CBD to also bind to live cells was confirmed in vivo by fluorescent microscopy with SH3b domain fused with GFP. Structure of CBD was determined by NMR. LysF1 was also tested for practical applications, it was used for staphylococcal DNA isolation and composition of lyofilized drug form where the enzyme remains stable was defined. In this study a tail hydrolase TmpD was identified on phage 812 particle and its CHAP domain lytic activity was confirmed. The domain was prepared as a recombination protein and purified for structural study purposes which determined its 3D structure. Tail hydrolase was localized in bacteriophage structure obtained from reconstruction by cryo-electron microscopy. Broad lytic spectrum of LysF1 and its high activity make it a suitable candidate for practical use as an antimicrobial agent. Also the results of DNA isolation were comparable to lysostaphin and good stability in lyofilized tablets confirms these positive preconditions. Genus specificity was not confirmed in CBD, therefore its diagnostic use should be considered. However, the broad spectrum of its bond to various peptidoglycans makes it suitable for combination with catalytic domains to create new chimeric lysins with higher activity.

Kľúčové slová

Bakteriofágy, Staphylococcus aureus, endolyziny, peptidoglykanové hydrolázy, SH3b vazebná doména, antimikrobiální látky, bacteriophages, endolysins, peptidoglycan hydrolases, SH3b binding domain, antimicrobials

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 7. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 22. 9. 2017
• Vedúci: doc. RNDr. Roman Pantůček, Ph.D.
• Oponent: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr., Ing. Karel Klepárník, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology