Klonování a charakterizace substrátové specifity cytokininových receptorů z Brassica napus

Zuzana MIČKOVÁ

Master's thesis

Cloning and characterization of substrate specificity of cytokinin receptors from Brassica napus

Abstract:

Cytokininy jsou rostlinné hormony, které regulují řadu vývojových a fyziologických procesů v rostlině, např. buněčné dělení a diferenciaci, klíčení semen, vývoj květů a plodů, apikální dominanci, či senescenci. Prvním krokem signální dráhy cytokininů, jež vede ke specifické odezvě rostliny na cytokininový signál, je rozpoznání cytokininů pomocí příslušných receptorů. Cytokininové receptory vážou jednotlivé cytokininy s různou afinitou a liší se tak svou funkční specifitou. V rámci této diplomové práce byla pomocí ligand-vazebných testů s využitím intaktních E. coli exprimujících funkční receptory určena substrátová specifita vybraných cytokininových receptorů z Brassica napus, konkrétně receptorů BnCHK1 a BnCHK3. Jde o homology cytokinového receptoru z Arabidopsis thaliana AHK2. Bylo zjištěno, že oba vykazují shodně nejvyšší afinitu k trans-zeatinu, téměř žádnou k trans-zeatin glukosidům. Preference substrátů byla u obou receptorů stejná, ačkoliv všechny cytokininy byly vázány s vyšší afinitou receptorem BnCHK3. Dále byla určena ligandová specifita zkrácené varianty receptoru BnCHK1 s jednou chybějící transmembránovou doménou a pozorován vliv absence této domény na vazebné vlastnosti receptoru. Bylo zjištěno, že receptor BnCHK1 a jeho zkrácená varianta vykazují velmi podobnou substrátovou specifitu, což indikuje, že chybějící transmembránová doména nemá na vazebné vlastnosti receptoru zásadní vliv. V rámci této práce byl rovněž připraven pomocí technologie Gateway konstrukt BnCHK3 v cílovém vektoru pDEST14. Gen vložený do Gateway vektoru může být snadno přenesen do mnoha dalších vektorových systémů, čehož bude využito při dalším studiu genu BnCHK3 a jím kódovaného cytokininového receptoru.

Abstract:

Cytokinins are phytohormones, which regulate a lot of devolopmental and physiological processes in plant, for example cell division and differentiation, seed germination, development of blooms and fruits, apical dominance or senescence. The first step of cytokinin signaling pathway, which leads to specific responses of plants to cytokinin signal is recognition of cytokinins by corresponding receptors. Cytokinin receptors bind various cytokinins with different affinity and so they differ in their functional specificity. This diploma thesis deals with the characterization of substrate specificity of cytokinin receptors from Brassica napus BnCHK1 and BnCHK3. Ligand-binding properties of the receptors were determined using live cell ligand-binding assay with E. coli, which expressed functional receptors. BnCHK1 and BnCHK3 are homologs of cytokinin receptor of A. thaliana AHK2. It was found that both of them show the highest affinity for trans-zeatin and no affinity for trans-zeatin glucoside. In a bacterial assay, BnCHK1 has a similar ligand-binding spectrum as BnCHK3, but all cytokinins are bound with higher affinity to BnCHK3. Ligand specificity of reduced version of receptor BnCHK1 with one missing transmembrane domain was also determined. It was found that there is not big difference in preference of substrates in case of receptor BnCHK1 and its reduced form, indicating that absence of the transmembrane domain has not major impact to binding properties of the receptor. In this work, construct BnCHK3 in destination vector pDEST14 was also prepared using Gateway technology. The gene inserted into Gateway vector can be easily transferred into multiple vector systems which will be used in further studies of gene BnCHK3 and corresponding cytokinin receptor.

Keywords

cytokininy, cytokininové receptory, substrátová specifita, ligand-vazebný test, Brassica napus

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 8. 2014

Accessible from:: 22. 8. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 28. 8. 2014
• Supervisor: Mgr. Lucia Gallová

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry