Změny genomu indukované expresí fragilních míst a ztrátou genů kódujících proteiny asociované s chromatinem

Bc. Adéla Machelová

Diplomová práce

Genome changes induced by the expression of fragile sites and the loss of genes encoding proteins associated with chromatin

Anotace:

Tato diplomová práce se zabývá analýzou vybraných genů asociovaných s chromatinem, tzv. CHR genů a vybranými repeticemi, u rostliny A. thaliana. CHR geny kódují faktory podílející se na remodelaci chromatinu, jež je nezbytná pro replikaci, transkripci i reparaci DNA, a tedy pro stabilitu genomu. Z hlediska replikace, mezi nejméně stabilní místa genomu patří repetice. V této práci jsem se zabývala dvěma typy repetic – telomerami, což jsou nukleoproteinové komplexy chránící konce chromozomů; a úseky ribozomální DNA (rDNA), kódující ribozomální RNA, jež jsou důležitou součástí ribozomu. Pomocí inhibitoru replikace aphidicolinu (APH) a transkripce actinomycinu D (ActD) je možno zviditelnit nestabilní úseky DNA ve formě zúžení na chromozomech, označované jako fragilní místa. Díky své nestabilitě jsou fragilní místa vhodná pro studium mechanismů odpovědných za udržování genomové integrity. Experimentální část této práce je zaměřena na selekci mutant s T-DNA inzercí v CHR genech rostliny A. thaliana, u nichž byly stanoveny délky telomer a počty kopií rDNA. V rámci této práce bylo zjištěno, že u mutant chr4 a chr24 dochází ke zkrácení telomer a úbytku rDNA; mutant chr5 vykázal ztrátu rDNA; u mutanta chr7 byl zjištěn nárůst rDNA a zkrácení telomer. Stejně tak bylo pozorováno zkrácení telomer u chr2, chr11 a rcc1. Dále bylo testováno, zda je možné detekovat fragilní místa v genomu A. thaliana pomocí dvou inhibitorů ActD a APH. Testovali jsme mutanty fas2, kde dochází k poruše sestavování nukleozomu spojené se změnou epigenetického profilu chromatinu a progresivní ztrátě rDNA a telomer. Další linii ve studii představovala mutanta atmfas1, kde odstraněním kinázy ATM dochází k potlačení úbytku rDNA a linie, E27, což je genotypově WT linie, kde je rDNA nahromaděna pouze do jednoho lokusu. Výsledky experimentů ukázaly, že nejvyšší míra dekondenzace rDNA byla pozorována u WT rostlin a linie E27, zatímco mutanty fas2 nevykazovaly oproti kontrole významné rozdíly. U mutant atmfas1 byly pozorovány pouze mírné náznaky dekondenzace chromatinu. Atmfas1 rostliny také ukázaly zajímavou distribuci rDNA lokusu podobnou linii E27, s akumulací rDNA na jednom ze dvou lokusů.

Abstract:

This thesis is focused on analysis of selected chromatin-associated genes (so called CHR genes) and selected DNA repeats in Arabidopsis thaliana plants. These genes encode the factors involved in chromatin remodeling, which are necessary for DNA replication, transcription and DNA repair. These factors thus affect genome stability. Repetitive sequences are the least stable genome sites because they represent a hard template for DNA polymerases during replication. In this thesis I focused on two types of repeats – telomeres and ribosomal DNA (rDNA). Telomeres are nucleoprotein complexes protecting the ends of chromosomes, while ribosomal DNA encodes genes for ribosomal RNA, a key component of ribosomes. By using the replication inhibitor aphidicolin (APH) and the transcription inhibitor actinomycin D (ActD), instable genomic sites can be seen in the form of chromosomal constricts, so called fragile sites. Fragile sites, because of their instability, represent an ideal model to study the mechanisms that are responsible for genomic integrity maintenance. The experimental part of this thesis is focused on selection of A. thaliana mutants with T-DNA insertions in CHR genes, and determination of telomere lengths and rDNA copy numbers. In this thesis we observed the telomere shortening and rDNA loss in chr4 and chr24 mutants. Chr5 mutant showed rDNA loss. Telomere shortening was also seen in chr7 mutant together with the increased rDNA copy number. We further observed shorter telomeres in chr2, chr11 and rcc1 mutants as well. Furthermore, we have been tested possibilities of detection of the fragile sites by ActD and APH. We tested fas2 mutants that lacking correct nucleosome assembly associated with the change of epigenetic state of chromatin and showing progressive loss of rDNA and telomeres. Another line in the study was the atmfas1 mutant, where disruption of the ATM kinase suppresses the loss of rDNA. Last line used in this study was E27, which shows WT genotype, but the rDNA accumulates in only one loci. Our results show, that the highest rate of rDNA decondensation is observed in WT plants and E27 lines, whereas fas2 mutants did not show significant differences in comparison to the control. In the atmfas1 mutant, only mild indications of chromatin decondensation was observed. Atmfas1 plants also showed an interesting distribution of the E27-like rDNA locus, with accumulation of rDNA at one of two loci.

Klíčová slova

remodelace chromatinu, 45S rDNA, telomery, fragilní místa, chromatin remodeling, telomeres, fragile sites

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2018
• Vedoucí: Mgr. Martina Dvořáčková, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Michal Franek, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie