Analysis of luciferase enzymes by molecular modeling

Mgr. Jana Horáčková, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Bioluminiscenční enzymy luciferázy se hojně uplatňují v biotechnologiích i biomedicíně jako reportérové geny, biosenzory či potenciální léčebné prostředky. Přesto však nebyly katalytické principy, které stojí za jejich aktivitou, dosud dostatečně prozkoumány. Tato disertační práce se věnuje této problematice prostřednictvím srovnávací analýzy přírodních, uměle vytvořených i ancestrálních luciferáz s využitím metod molekulového modelování. Byly popsány strukturní a mechanistické základy aktivity luciferázy NanoLuc, přičemž bylo odhaleno alosterické vazebné místo komunikující se zanořeným aktivním místem, čehož lze využít k návrhu vylepšených variant. Dále byla studována kinetika luciferáz typu Renilla, kde byla jako hlavní rychlost-limitující bariéra identifikována konformační změna spojená s odchodem produktu a bylo ukázáno, že racionální návrh smyček může zlepšit světelnou emisi. Nakonec byl zkoumán evoluční původ luciferázové aktivity u ancestrální luciferázy příbuzné haloalkan dehalogenázám, což vedlo k odhalení, že relativně malé strukturální změny umožnily vznik bioluminiscence. Tyto studie společně objasňují základní principy luciferázové reakce, zdůrazňují roli dynamiky a přístupových cest vedle chemie aktivního místa a vytvářejí konceptuální rámec pro racionální vývoj vylepšených bioluminiscenčních nástrojů.

Abstract:

Bioluminescent luciferase enzymes are widely utilized in biotechnology and biomedicine as reporter genes, biosensors, and potential therapeutic agents. Despite their extensive applications, the catalytic principles governing luciferase activity remain underexplored. This thesis addresses this gap through a comparative analysis of natural, artificial, and ancestral luciferases using molecular modeling techniques. The structural and mechanistic basis of NanoLuc activity was explored, revealing an allosteric binding pocket that communicates with the buried active site and can be harnessed for engineering enhanced variants. In the next step, the kinetic behavior of Renilla-type luciferases was investigated, identifying a conformational gating step as a major rate-limiting barrier, and demonstrating that rational loop design can improve light emission. Finally, the evolutionary origins of luciferase activity were examined in an ancestral luciferase related to haloalkane dehalogenases, showing how modest structural changes enabled the emergence of bioluminescence. Together, these studies reveal the underlying principles of luciferase catalysis, emphasize the role of dynamics and access pathways alongside active-site chemistry, and establish conceptual foundations for the rational development of improved bioluminescent tools.

Keywords

bioluminiscence, luciferáza, RLuc, NanoLuc, molekulové modelování, dokování, molekulová dynamika, MD, bioluminescence, luciferase, molecular modeling, docking, molecular dynamics

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 20. 10. 2025

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 21. 11. 2025
• Vedoucí: doc. Mgr. David Bednář, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Marian Novotný, Ph.D., prof. Ing. Vojtěch Spiwok, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Životní prostředí a zdraví / Matematická biologie, bioinformatika a modelování